（高清版）DB62∕T 4634-2022 牛结节性皮肤病血清学诊断技术

DB62/T4634—2022牛结节性皮肤病血清学诊断技术2022-10-20实施2022-10-20实施本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由甘肃省农业农村厅提出并监督实施。本文件由甘肃省畜牧业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所、甘肃省动物疫病预防控制中心、静宁县畜牧兽医中心。本文件主要起草人：景志忠、高建平、唐豪、陈国华、张勇、房永祥、何小兵、景伟、李维克、贾怀杰、娄忠子、张春祥、付宝权。I本文件规定了牛结节性皮肤病的血清学诊断方法及其综合判定。本文件适用于牛结节性皮肤病的快速诊断、检疫和流行病学调查。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本GB19489实验室生物安全通用要求GB/T39602牛结节性皮肤病诊断技术NY/T541兽医诊断样品采集、保存和运输技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。牛结节性皮肤病lumpyskindisease(LSD)又名牛疙瘩皮肤病，是由痘病毒科脊椎动物亚科山羊痘病毒属的牛结节性皮肤病病毒(LSDV)感染牛引起的一种传染病，主要由吸血节肢动物传播，其临床特征主要为发热，皮肤、黏膜和内脏器官表面的广泛性结节，淋巴结肿大，动物消瘦，产奶量降低，不孕、不育和流产，以及无症状的隐性损伤和继发感染等表现。4样品采集与生物安全管理LSD临床病例检查与剖检，诊断检测样品的采集、运输和处理按照GB/T39602和NY/T541执行；实验室血清学试验以及待检样品、培养物和废弃物处理中的生物安全管理均按GB19489的相关规定执行。5病毒中和试验(VNT)MEM培养液，绵羊羔睾丸细胞(LTc),MDBK细胞，LSDV抗原及标准阳性、阴性血清，待检血5.2方法12将log₁06TCIDso/mL的山羊将第1份灭活的待检血清50μL分别加到微量滴定板A到H行的第1、第2列孔中，第2份血清加到第3、第4列孔中，第3份血清加到第5、第6列孔中，第4份血清加到第7、第8列孔中，阴性对照血清加到第9、第10列孔中，50μL不含血清的Eagle's/HEPES液分别加到第11、第12列以及H行的所有孔中。从G行开始用最大稀释度的病毒液50μL,加到该行的每个孔中。依加入到相应行的各孔中，直到最小病毒稀释物加到A行。从培养第3d开始，在倒置显微镜下每天观察单层细胞的细胞病变效应(CPE)情况，直至第9d,H行细胞应无CPE。以待检血清最高稀释度50%保护为该待检血清中和效价，以能保护细胞免受感染的最6.1.1浓缩胶：由5%聚丙酰胺Tris(125mM,pH6.8)和SDS(0.1%)组成；6.1.2分离胶：由10%～12.5%聚丙酰胺Tris(560mM,pH8.7)和SDS(0.1%)组成；6.1.3甘氨酸电泳缓冲液：250mMTris、2M甘氨酸和0.1%SDS;6.1.4封闭液：3%BSA和0.05%Tween20PBS,或5%奶粉和0.05%Tween20PBS;DB62/T4634—206.1.6标准蛋白分子质量marker,硝酸纤维素膜(NCM),病毒粒子抗原或重组蛋白抗原。将待检血清，包括阳性血清、阴性血清各1份，用封闭液1:50稀释血清，56℃±0.5℃灭活30min后当山羊痘病毒属病毒感染LTc的CPE达到90%时收获细胞，冻融三次，离心，取上清转移到一个新管，加病毒裂解液煮沸5min,作为组织培养的病毒粒子抗原。也可用体外表达的重组蛋白代替病毒粒子6.2.3SDS/PAGE分析将制备的病毒粒子抗原或重组蛋白抗原与标准蛋白分子质量marker同时分别上样，加到SDSPAGE凝胶孔中，在甘氨酸电泳缓冲PBS充分冲洗，并用3%牛血清白蛋白PBS或5%脱脂奶粉PBS在旋转振荡器上4℃±0.5℃封闭过夜。将NCM按组别剪成数个纸条，用PBS在旋转振荡器上彻底冲洗5次，的血清(包括阳性和阴性对照血清)中在室温下震荡1.5h,再次充分洗涤NCM,并孵育在特定稀释的辣震荡孵育3min～7min,在NCM背景即将变色之前用PBS样品不出现杂交条带，表示试验成立。待检血清样品至少出现一条杂交带即注：抗副痘病毒(牛丘疹性口炎或伪牛痘病毒)的高免血清可与LSDV的一些蛋白反应，但不与32kDa蛋白反应，以区7间接ELISA法pH9.6);7.1.3浓缩洗涤缓冲液(25×PBST)(89.5gNa₂HPO412H₂O,5gKH₂PO₄,5gKCl,200gNaCl,5mL3学兔兔标准下载47.1.4封闭缓冲液：0.02molL磷酸盐缓冲液+3%BSA(0.2g磷酸二氢钾，2.9g磷酸氢二钠，8g氯化钠，30gBSA,加去离子水定容到1000mL);7.1.52M终止液(111mL浓硫酸(H₂SO₄),899mLH₂O,30μLProclin300)。用稀释液对辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG作1:20000稀释(工作浓度为1:10000～1:20000),每取出微孔板，每孔加终止液(2mol/LH₂SO₄)50μL。7.3.1试验成立条件若阴性对照OD450值<0.3,阳性对照OD₄50值(P)>1.0,P/N值>3,则试验成立，结果有效。7.3.2S/N值计算每份待检样品的OD450值(S),除以参考阴性对照的OD450值(N),则得出每份待检样品的SN值。如果每份待检样品或阴、阳性对照有多孔重复，则应计算平均值后再计算S/N值。7.3.3判定标准待检样品的S/N≥2,则判定该样品为阳性；SN<2,则为阴性。8竞争ELISA法8.1材料山羊痘病毒属病毒抗原或重组蛋白抗原，竞争抗体工作液，鼠抗兔辣根过氧化物酶结合物，LSDV标准阳性血清、标准阴性血清，洗涤缓冲液(PBST),封闭缓冲液；TMB底物，2M终止液。8.2方法8.2.3抗原包被8.2.4竞争抗体制备用PBS将山羊痘病毒属病毒抗原或重组蛋白抗原稀释成200μg/mL,与弗氏完全佐剂按体积1:1混合，乳化后采用皮下多点注射免疫健康实验家兔，每只接种免疫1mL;第一次免疫间隔14d后，用第一次免疫相同的疫苗和剂量进行第2次免疫；第二次免疫再间隔14d后，用加倍蛋白抗原与弗氏不完全佐剂疫苗进行第3次免疫；用第三次免疫相同的疫苗和剂量进行最后一次免疫，免疫接种后14d从家兔心脏采血，稀释为竞争抗体工作液。8.2.5加血清样品取已包被抗原的酶标板，每次检测设标准阳性血清对照、阴性血清对照及空白对照孔，其中标准阳性血清对照设2孔，阴性血清对照设2孔，每孔加入相应血清(阳性或阴性对照血清)50μL/孔；空白对8.2.6加竞争抗体56用稀释液(即洗涤液)对辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔IgG作1:8000稀释(工作浓度为1:1000~