DB13T 2051-2014 幼羔体外胚胎生产技术规程

DB13DB13/T2051—2014幼羔体外胚胎生产技术规程2014-07-07发布2014-07-31实施河北省质量技术监督局发布I12规范性引用文件4供体选择要求健康、体况发育良好、系谱资料完整清楚、出生4～10周龄的5诱导卵泡发育5.1所使用的生殖激素5.2诱导卵泡发育方法2间隔12h对供体连续4次进行等剂量肌肉注射采卵室及检卵室适宜温度为20℃~25℃。），），），），含0.9%NaCl的生理盐水，含有0.96万IU青霉素/mL和0.2万IU/mL链霉素的生理盐水，速眠新及苏醒采卵液配方：9.5g/LTCM199+5mmol/LNaHCO3+10mmol/LHEPES+10mmol/LHEPES-Na+0.665g/L为0.015mL～0.022mL/kg体重；波尔山羊等肉用山羊为0.020mL～0.030mL/kg体重；奶山羊、绒山羊为0.023mL～0.033mL/kg体重；小尾寒羊为3短，再用温肥皂水浸湿，然后用剃须刀将毛剃净术部用5%碘酊棉球涂擦，待其干燥后，用75%酒精棉球脱碘。然后用有孔创巾覆盖于术部区域，用苏醒灵，剂量为速眠新用量的1～2倍。肌注青在3.5cm（Nunc）培养皿上标记组别、日期等，做100μL的培养滴，覆盖矿物油。另取一只1.5mLE2+1mmol/LL-谷氨酰胺+20ng/mLEGF+2提前打开恒温台调至38.5℃并用75%酒精消毒，分别取3cm、9cm塑料平皿（国产）各4个、5个，将取经过预平衡的成熟液在培养皿中做液滴4～5个，每个液滴的体积为100μL，依次和湿度的5%CO2培养箱中，成熟培养24h。8体外受精4在3.5cm（Nunc）培养皿上标记组别、日期等，做30μL的受精滴，覆盖石蜡油。另取一只1.5mL离心管，吸取1mL的受精液放入离心管中，做好标记，用于洗涤精子，必要时调整精子密度。取1个4心管，装2mL的SOF液，用于精子上浮。取1个200μL的离心管装100μL的0.1%透明质酸酶，将平其中SOF液配方：10%StockA（v/v）+5.262mmol/LNaHCO3+2CaCl22O+8%StockE(v/v)+2%发情羊血清（），8min。弃上清，用受精液调整精子密度为1.将脱除卵丘颗粒细胞的卵丘卵母细胞复合体在受精液中洗3～4遍后，放入受精液微滴中，每滴159体外胚胎发育培养9.1胚胎发育液预平衡另取一只1.5mL离心管，吸取1mL的发育培养I液放入离心管中，做好标记。将平皿和离心管（开盖）放发育培养Ⅰ液：SOF液+1%EAA+1%NEAA+10ng/mLEGF+1发育培养II液：I液+10%FBS（v/发育培养III液：I液+10%FBS（v/v）+1%9.2脱除精子及卵丘颗粒细胞5的混合气(5%CO2，5%O2，90%N2)培养箱中培养。9.3更换发育液料袋中，袋内置入湿棉球并充入混合气(5%CO2，5%O2，90%N2)，放入38.5℃、饱和湿度的5%CO26NaClKH2PO4MgSO4-7H2ONaHCO3水水CaCl2-2H2O水HEPES-Na水7水水