分解尿素的细菌的分离和计数-Alan

课题2土壤中分解尿素的细菌的别离与计数第一页，共三十页。一、课题背景1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。2、细菌利用尿素的原因CO(NH2)脲酶+CO2NH3+H2O第二页，共三十页。课题目的①从土壤中别离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌第三页，共三十页。

1、实例：原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。PCR,此项技术要求使用耐高温〔930C〕的DNA聚合酶。㈠.筛选菌株筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物生长。第四页，共三十页。不加有机碳源

不加氮源2.选择培养基的制作方法自养微生物酵母菌和霉菌固氮微生物参加青霉素加高浓度食盐金黄色葡萄球菌第五页，共三十页。15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43.土壤中分解尿素的细菌的别离与计数所需培养基：①从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基第六页，共三十页。②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。4、培养基选择分解尿素的微生物的原理第七页，共三十页。如当石油是唯一碳源时，可抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，从而别离出能消除石油污染的微生物。筛选能够分解石油的微生物？第八页，共三十页。1.使用选择培养基的目的是〔〕A.培养细菌B.培养真菌C.使需要的微生物大量繁殖D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素实践训练CD第九页，共三十页。5、怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为唯一氮源的培养基牛肉膏蛋白胨培养基

是别离尿素细菌判断该培养基有无选择性实验组对照组培养基类型是否接种

目的

结果只生长尿素细菌生长多种微生物是第十页，共三十页。微生物的培养与观察第十一页，共三十页。鉴定：在以尿素为唯一氮源的培养基中参加酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红美蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。第十二页，共三十页。大肠杆菌呈黑色中心,有或无金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征

第十三页，共三十页。1、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。㈡.统计菌落数目：缺点：不能区分死菌与活菌；2、稀释涂布平板法：活菌第十四页，共三十页。2.稀释涂布平板法⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M缺点：统计的菌落往往比活菌的实际数目低。第十五页，共三十页。二.实验的具体操作

㈠.土壤取样

从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。㈡.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。第十六页，共三十页。◆应在火焰旁称取土壤10g。◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行[三]样品的稀释第十七页，共三十页。㈣.取样涂布◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。第十八页，共三十页。㈣.取样涂布◆别离不同的微生物采用不同的稀释度稀释倍数目的细菌104、105、106保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板放线菌103、104、105真菌102、103、104原因：不同微生物在土壤中含量不同第十九页，共三十页。㈤.微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间缺乏而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：30～37℃培养1～2d放线菌：25～28℃培养5～7d霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。第二十页，共三十页。◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，那么说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，说明试验不精确，需要重新实验。第二十一页，共三十页。本卷须知①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。第二十二页，共三十页。设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。㈢.设置对照：第二十三页，共三十页。实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106

倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。原因：⑴土样不同，⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质)第二十四页，共三十页。小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：如果结果与A同学一致，那么证明A无误；如果结果不同，那么证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。第二十五页，共三十页。四、操作提示

无菌操作

做好标记

规划时间

第二十六页，共三十页。4.以下说法不正确的选项是〔〕A.科学家从70－80度热泉中别离到耐高温的TaqDNA聚合酶B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。5.为培养和别离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中参加〔〕A.较多的氮源物质B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物