人类SMN1和SMN2基因检测试剂盒（PCR-毛细管电泳法）（CSZ2400022）

申请人名称：厦门百欧迅生物科技有限公司 3 3 3 3 4 4 6 12 14 17一、申请人名称厦门百欧迅生物科技有限公司二、申请人住所厦门市海沧区翁角西路2032号厦门生物医药产业园A17三、生产地址厦门市海沧区翁角西路2032号厦门生物医药产业园A17号楼一、产品概述（一）产品主要组成成分本试剂盒含有SMA反应液、SMA引物混合液、酶C、SMA正常对照、SMA质控品1、SMA质控品2、和SMA空白对照，详见表1产品主要组成成分11111SMA质控品211（二）产品预期用途本试剂盒用于体外检测EDTA抗凝全血样本中人运动神经元存活基因1（SMN1）和运动神经元存活基因2（SMN2）第7号的辅助诊断，SMN2基因拷贝数用于SMA患者分型的辅助判断，检测结果供临床参考，临床医生应结合患者临床表现进行综合脊髓性肌萎缩症（SMA）为一种常染色体隐性遗传疾病，临床特征为脊髓前角运动神经元退化凋亡导致对称性肌无力和肌萎缩。其病因是由于位于5号染色体上的运动神经元存活基因1（SurvivalofMotorNeuron1,SMN1）突变所致。正常人至少有2拷贝正常的SMN1基因，携带者仅1条5号染色体上有正常SMN1基因，而SMA患者没有正常SMN1基因，即0拷贝正常SMN1突变包括第7号和/或第8号外显子缺失以及点突变等1/10,000-1/6,000，人群携带率为1/50-1/40。与SMN1高度同源的运动神经元存活基因2（SurvivalofMotorNeuron2,SMN2两基因序列上仅有5个碱基的差异，其中2个碱基位于splicingenhancer导致只有少量的全长SMNmRNA生成，使得功能性SMN蛋白的表现量减少。SMN2为临床表型的调节基因，影响病情的严重程度，其拷贝数增加可减轻SMA患者表型症状。因此，检测SMN2基因的拷贝数有助于为疾病分型提供参（三）产品包装规格48测试/盒，96测试/盒。（四）产品检验原理和SMN2。以HBB与ACTB基因为内标基因，监控PCR反应效率，拷贝数进行相对定量的检测，区分0、1、2、3、≥4拷贝的SMN1与SMN2基因。二、临床前研究概述（一）主要原材料本产品的主要原材料包括引物、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、热启动核酸聚合酶，均为外购。通过功能性试验，申请人筛选出最佳原材料和供应商，同时制定了各主要原材料质量标准并ACTB基因、HBB基因，SMA空白对照主要原料为10mMTris8.5溶液，并按照相应的质量标准进行检测合格后使用。本产品的企业参考品包括阳性参考品、阴性参考品、精密度参考品及检测限参考品。企业参考品采用临床血液样本或细胞系进行提取的基因组DNA制备，并以SMA检测金标准荷兰MRC-Holland公司研制的SALSA®MLPA®ProbemixP021-B1SMA确认其基因拷贝数。（二）生产工艺及反应体系研究本试剂盒的反应体系的研究包括PCR反应液中各组份配方与用量的调整、DNA酶用量的确定；对PCR反应条件的研究包括退火温度、扩增循环数、扩增循环数中各阶段时间、最后延伸时间的测试；毛细管电泳的上机程序进行测试调整；确认PCR过程的质量控制，包含内控基因设计、拷贝数计算公式的确认；完成样本提取DNA纯度、浓度以及重复性和反应投入量研究，并对产品适配的PCR仪和毛细管电泳仪AppliedBiosystems®3500Dx/3500xLDxGeneticAnalyzers的检测结果进行研究。根据试剂盒中试剂及组件的主要生产工艺的研究结果，确定了最佳的生产工艺。（三）分析性能评估本产品分析性能评估内容包括准确度、精密度、最低检测限、分析特异性和提取试剂性能的研究。准确度研究使用共检测43例覆盖SMN1和SMN2基因各不同拷贝数（0、1、2、3、≥4）的临床EDTA抗凝全血样本，使用三批次的试剂盒进行检测，均能准确检测SMN1和SMN2不同拷贝数（0、1、2、3、≥4）组合的样本，包含纯合缺失型、杂合缺失型和无缺失型相应的拷贝数，检测符合率100%。2.精密度精密度研究使用不同拷贝数组合的临床样本，提取后在低与中高浓度水平进行检测。分别考察室内精密度、试剂盒批内与批间精密度、操作人员间精密度、实验室间精密度，结果表明各项不精密度变异系数均不大于10%。3.最低检测限在最低检测限建立的研究中，首先使用SMN1和SMN2基因提取基因组DNA，梯度稀释DNA样本各进行3次重复平行检测，对检测限进行初步考察；根据预估检测限的最高与最低浓度附在最低检测限验证的研究中，另取SMN1和SMN2基因各不同拷贝数（0、1、2、3、≥4）的临床EDTA抗凝全血样本，提各进行20重复平行检测，检出率为100%。4.分析特异性在干扰试验中，申请人对内源性干扰物质与常见治疗药物如三酸甘油酯（500mg/dL）、胆红素（15mg/dL）、血红蛋白丁胺醇（3μmole/L）、阿莫西林（400μmole/L）、头孢氨苄（600μmole/L）、乙酰胺基酚（3000μmole/L）、甲氧氯普胺（3μmole/L）与奥美拉唑（40μmole/L对本试剂盒检测结果均不造成影响。交叉反应评价中，申请人针对全血样本中常见的病原体进行研究，包括乙肝病毒、丙肝病毒、巨细胞病毒、肠道病毒71型，对本试剂盒检测结果不造成影响。使用高拷贝的SMN2对SMN1不同拷贝数样本进行交叉反应；高拷贝的SMN1对不同拷贝数SMN2的进行交叉反应研究，结果显示SMN1和SMN2基因不会对各自的检测结果造成影响。针对与SMA症状类似的疾病，如Duchenne型肌营养不良（DMD）、Becker型肌营养不良（BMD）进行交叉反应评价，对本试剂盒检测结果均不造成影响。针对SMN基因微小突变或者基因多型性位点进行研究，包括SMN1基因的微小突变c.22dupA、c.81+2_3delTG、c.683T>A，SMN1基因第7号外显子基因多型性rs555928635、SMN2基因第8号外显子基因多型性rs576032516，对本试剂盒检测结果均不造成影5.提取试剂性能研究采用临床样本进行了核酸提取试剂盒性能的研究，根据与该产品的组合性能研究结果，确定推荐的核酸提取试剂符合检（四）阳性判断值研究阳性判断值研究首先采用714例已知基因型的临床样本进行检测，同时使用SMA检测标准方法MLPA确认其基因拷贝数，采用ROC曲线法对本试剂盒的阳性判断值进行研究。最终确定阳性判断值按下表进行判读：0123≥4拷贝数正常区间采用另外一批168例经SMA检测标准方法MLPA检测的临床样本进行验证，检测结果与MLPA确认结果一致。（五）稳定性研究申请人对本产品在实际储存条件下保存至成品有效期后的实时稳定性、使用稳定性等进行了研究，确定了在各种条件下试剂的有效保存时间。实时稳定性：三批试剂放置于-20±5℃保存，按时间考察每批试剂盒在第0、3、6、9、12、14、18、19个月的性能，检测其外观、阳性参考品符合率、阴性参考品符合率、检测限与精密度，结果均符合要求；确定本试剂有效期为18个月。使用稳定性：考察试剂开瓶后在2～8℃5天内、-20±5℃在试剂盒效期内及反复冻融7次的性能，结果显示：产品外观符合要求，阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品与精密度参考品均符合要求。为确保产品性能稳定，要求本试剂盒在首次使用后，应尽快用完，如需长期保存，再次放置于-20±5℃可此外，申请人对产品的样本稳定性进行了研究。结果显示，产品性能均能满足产品说明书声称要求。三、临床评价概述本产品在浙江大学医学院附属儿童医院、深圳市儿童医院、湖南省儿童医院、南京市妇幼保健院、广州医科大学附属第三医院共五家临床试验机构进行临床试验，临床试验入组病例为疑似或确诊脊髓性肌萎缩症（SMA）的病例等，共入组病例975（一）采用试验体外诊断试剂与临床参考方法MLPA方法进行比较研究，确认本产品的临床检测性能。1.针对SMN1检测性能：临床参考方法检测结果为SMN1基因外显子7缺失阳性（拷贝数为0或1）471例，临床参考方法例，4拷贝1例。试验结果显示：本产品阳性符合率为100%100%）。临床参考方法检测结果为SMN1基因外显子8缺例，4拷贝3例。试验结果显示：本产品阳性符合率为100%2.针对SMN2检测性能：临床参考方法检测结果为SMN2外病例数分别为38例、191例、440例、280例、26例。试验结果显示：试验体外诊断试剂与参考方法符合率100%。上述结果显示试验体外诊断试剂与临床参考方法检测结果具有较好的一致性。采用试验体外诊断试剂与SMA的临床诊断结果进行了比较研究，确认本产品的临床性能。临床诊断结果为SMA病例26990.56%，96.31%特异度为100%（95%CI：99.46%，100%针对不一致的样本进行了充分分析和确认，其中假阴性的14例患1例患者在临床试验前有异基因非亲缘脐带血回输，1例为SMN1双等位基因均为微小致病性变异[1d+1d]型SMA患者；假阳性样本2例，该2例患者经随访确诊为SMA患者。上述结果显示两者之间具有良好的一致性，本产品针对SMA辅助诊断的临床性（三）针对SMN2基因拷贝数用于SMA患3拷贝、≥4拷贝）的检测结果与SMA患者分型的关系进行了分析，两者有较好的相关性。结果显示，本产品针对SMA分型辅助判断的临床性能满足要求。综上所述，临床试验结果显示本产品的临床性能满足技术审评要求。四、产品受益风险判定依据“YY/T0316-2016《医疗器械风险管理对医疗器械的本产品适用本产品适用于EDTA抗凝全血样本中人运动神经元存活基因1（SMN1）和运动神经元存活基因2（SMN2）第7SMN1基因拷贝数用于脊髓性肌萎缩症（spinalmuscularatrophy，SMA）的辅助诊断，SMN2基因拷贝数用于SMA患者分型的辅助判断，检测结果仅供临床参考，具体临床应用时，临床医生必须结合病例实际情况判读。本产品临床应用的主要受益在于：可作为脊髓性肌萎缩症的辅助诊断以及SMA患者分型的辅助判断的方法。（二）风险评估申请人对已知危险（源）进行风险评价，按照风险可接受准则判断每个危险（源）的风险是否达到可接受水平，对合理可行降低的风险、不经过风险/收益分析既判定为不可接受的风险采取控制措施，并对具体措施进行实施验证，同时重新对采取措施后的风险进行估计，确认其风险水平是否可接受。但为保证用械安全，基于对主要剩余风险的规避，需要在说明书中1.预期用途：用于体外检测EDTA抗凝全血样本中人运动神号外显子和第8号外显子拷贝数（0、1、2、3、≥4）的检测，SMN1基因拷贝数用于脊髓性肌萎缩症（spinalmuscularatrophy，SMA）的辅助诊断，SMN2基因拷贝数用于SMA患者分型的辅助判断，检测结果供临床参考，临床医生应结合患者临床表现进行综合判断。2.警示及注意事项：产品说明中明确了该产品检验方法的局限性及使用中的注意事项。注册与备案管理办法》（国家市场监督管理总局令第48号）等相关医疗器械法规与配套规章，经对申请人提交的注册申报资料进行系统评价,申报产品符合安全性、有效性的要求，符合现有认知水平，建议准予注册。附件：产品说明书1SMN1基因拷贝数用于脊髓性肌萎缩症（spinalmuscular检测结果供临床参考，临床医生应结合患者临床表现进为脊髓前角运动神经元退化凋亡导致对称性肌无力和肌萎缩。其病因是由于位于5号染色体上的运动神经元存活基因1（SurvivalofMotor的拷贝数有助于为疾病分型提供参考依据。因。下表为本试剂盒6个检测位点的位置、理论片检测位点理论片段长度荧光修饰基因HBB227bpFAMACTB368bpSMA基因SMN1第7号外显子（SMN1-EX7）257bpSMN2第7号外显子（SMN2-EX7）262bpSMN1第8号外显子（SMN1-EX8）306bpSMN2第8号外显子（SMN2-EX8）315bp组分名称主要成分规格(48测试/盒)规格(96测试/盒)数量(管)SMA反应液含dNTPs的PCR缓冲液750μL1500μL1SMA引物混合液含试剂盒检测位点及内标基因的特异性引物溶液150μL300μL1酶C热启动核酸聚合酶8μL16μL1SMA正常对照含SMA检测位点及内标基因的质粒18μL18μL1SMA质控品1含SMA检测位点及内标基因的质粒18μL18μL1SMA质控品2含SMA检测位点及内标基因的质粒18μL18μL1SMA空白对照Tris8.5溶液1500μL1500μL1开瓶后未使用完的组分于-20±5℃保存不影响产品有效期。应本试剂盒采用普通PCR仪扩增后再经毛细管电泳仪进行AppliedBiosystems®3500Dx/3500xLDxGe），注：建议当次检测样本与对照的样本处理方式、DNA提取2.2按下表配制扩增试剂：组分每反应体积SMA反应液15µLSMA引物混合液3µL酶C0.16µL总体积*18.16µL*为了减少分液误差，建议在配制扩增试剂时根据样本数量（n）分别取（n+1）人份的反应液和混合酶。n=待测样本数+SMA空白对照1份+SMA正常对照1份+SMA质控品1+SMA质控品2。2扩增。反应体积设定：20μL，建议立即进行则应将PCR扩增产物保存于-20±5℃,不超过1周。步骤循环数温度时间1195ºC5min22595ºC30sec57ºC30sec72ºC30sec3172ºC30min414ºC∞3500Dx/3500xLDxPOP-750cm8133019.5进行片段大小分析，分析参数设置和结果分析具体信息请参考制造扩增产物范例图检测峰选择HBB检测峰面积Test/IC检测峰面积之和TestHBB检测峰面积RS/IC检测峰面积之和RSSMN1-EX7检测峰面积Test/IC检测峰面积之和TestRSMN1-EX7=SMN1-EX7检测峰面积RS/IC检测峰面积之和RSSMN2-EX7检测峰面积Test/IC检测峰面积之和TestRSMN2-EX7=SMN2-EX7检测峰面积RS/IC检测峰面积之和RSSMN1-EX8检测峰面积Test/IC检测峰面积之和TestRSMN1-EX8=SMN1-EX8检测峰面积RS/IC检测峰面积之和RSSMN2-EX8检测峰面积Test/IC检测峰面积之和TestRSMN2-EX8=SMN2-EX8检测峰面积RS/IC检测峰面积之和RSACTB检测峰面积Test/IC检测峰面积之和TestRACTB=×2ACTB检测峰面积RS/IC检测峰面积之和RS【阳性判断值】检测峰比值结果判读基因拷贝数<0.370拷贝数正常区间00.37≤R<0.651拷贝数检测灰区10.65≤R<1.301拷贝数正常区间1.30≤R<1.411拷贝数检测灰区1.41≤R<1.552拷贝数检测灰区21.55≤R<2.402拷贝数正常区间2.40≤R<2.452拷贝数检测灰区2.45≤R<2.503拷贝数检测灰区32.50≤R<3.463拷贝数正常区间3.46≤R<3.503拷贝数检测灰区≥3.50≥4拷贝数正常区间≥43检测位点片段大小范围（bp）HBBSMN1-EX7SMN2-EX7SMN1-EX8SMN2-EX8ACTB2.1检测峰比值（R）落于正常区间，根据显子拷贝数一致；当发生基因转换时，基因型表示为于检测灰区，需重新进行PCR，检测结果按【读，若检测峰比值（R）还是落于检测灰区，按相应拷贝数贝数之和不一致，如当检测结果为2:2/2:3时，第7外显子这种即为总拷贝数不一致，应该重新进行检测。重测后以总拷贝数一致的结果进行判读，若重测后拷贝数之和仍不一致，建议结合其2.5若引物扩增区域内出现缺失或插入的罕见基因突变或基因多型性一致性，进行拷贝数判读，进一步的突变或基因多态性信息应结合2.本试剂盒以染色体上特定的DNA序列为检测目标，5.不合理的样本采集、转运及处理、以及不当的试验操作