《广西《猪主要病毒性腹泻防控技术规范》编制说明》

一、项目背景、来源及目的

1、项目背景

猪病毒性腹泻是指由病毒引起的急性消化道传染病，其主要病原有猪

流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）、猪传染性胃肠

炎病毒（Transmissiblegastroenteritisvirus,TGEV）、猪轮状病毒（Porcine

rotavirus,PRoV）、猪德尔塔冠状病毒（Porcinedeltacoronavirus，PDCoV）

等，以厌食、呕吐、腹泻、脱水为主要特征，发病率和死亡率可高达100%，

给养猪业造成巨大的经济损失。起草团队重点针对4种猪主要病毒性腹泻

病原（PEDV、TGEV、PRoV、PDCoV）所致的腹泻性疫病，集成创新和

推广应用各种关键防控技术，制定成防控技术规范，作为广西地方标准加

以推荐实施，以有效防控猪主要病毒性腹泻的发生、传播及流行，促进广

西养猪业健康可持续发展。

猪场良好的环境控制和管理制度以及严格的生物安全措施是防控好猪

主要病毒性腹泻的前提条件。引种检疫是养猪生产中一项重要的保障措施。

养猪场积极配合并执行严格规范的引种及隔离检疫，可从源头杜绝疫病的

引入及传播。科学合理的免疫接种是预防和控制猪主要病毒性腹泻的关键

技术。搞好疫病监测是做好疫病免疫和防病措施的保障。疫病监测包括临

床症状观察、血清学监测和病原学检测。进行日常临床症状观察，可及时

发现猪群异常情况，尽早采取相应防控措施。进行血清学定期监测（一般

每季度应进行一次），可掌握猪群的免疫状况及疫病发生风险，及时调整

和确定最佳免疫计划，为淘汰和消除亚临床感染或隐性感染猪提供依据。

病原学检测可为快速确诊、明确病因和及时采取针对性防控措施提供技术

支持。根据不同疫病的免疫及定期监测结果，按照国家及广西相关法律法

规进行相应处置，以杜绝或消除疫病的发生与传播，对保障猪群健康、提

高猪场经济效益具有重要意义。

2、项目来源

1

根据《广西壮族自治区市场监督管理局关于下达2018年第二批广西地

方标准制定项目的通知》（桂市监函[2018]253号），自治区市场监督管

理局将广西地方标准《猪主要病毒性腹泻防控技术规范》的制定下达给广

西动物疫病预防控制中心，项目编号2018-0270，由施开创研究员主持。

3、项目目的

经资料检索，目前未发现国内外有集成制定针对PEDV、TGEV、PRoV、

PDCoV等主要病毒所致腹泻的综合防控技术的国家标准、行业标准或地方

标准。

本标准根据课题组前期调研及相关研究积累，结合广西猪病防控实际，

针对当前应重点防控的4种猪主要病毒性腹泻，集成制定防控技术规范作

为广西地方标准，使其更具针对性、适用性、可操作性和先进性。

二、工作概况

施开创研究员从2015年1月起主持开展广西水产畜牧科技项目《猪流

行性腹泻病毒Nsp1蛋白调控天然免疫信号通路的机制与推广应用》（桂渔

牧科201528017），从2017年9月起主持开展广西科技重大专项《畜禽重

大病害生态综合防控技术创新示范》（桂科AA17204057）子课题。课题

组在猪主要病毒性腹泻的诊断、检测和防控措施等方面开展了大量研究和

临床推广应用。同时，开展了相关资料的收集整理工作，确定标准编写目

标和依据，同时起草制订广西地方标准项目建议书，积极开展标准的申报。

2018年12月接到自治区市场监督管理局下达的地方标准制定（修订）项

目计划的通知后，迅速成立标准编制课题组，确定标准起草编写方案及时

间进度表，并积极组织实施。2019年8月31日已完成标准初稿的编写。

本标准编制课题组人员包括：施开创、冯淑萍、粟艳琼、陈芳芳、尹

彦文、屈素洁、陆文俊、莫胜兰、李军。各成员均具备多年专业知识，并

且有丰富的实验室检测、临床诊治工作经验和地方标准编写经验，能保障

制定本标准起草任务。具体分工如下：

施开创：组长。负责标准的提出、起草、审定。

2

冯淑萍：负责标准的起草、校正、外联。

粟艳琼：负责标准起草。

陈芳芳：负责标准起草。

尹彦文：负责标准验证。

屈素洁：负责标准验证。

陆文俊：负责比对试验。

莫胜兰：负责比对试验。

李军：负责标准稿审核。

三、标准编制原则

1、政策性原则：本标准编写过程遵循国家相关法律、法规和国家标准。

2、先进性原则：以国内外相关文献资料为参考，力求反映最新的科技

成果；以国内同类标准的编写方法为基础，对本标准进行规范、充实和创

新，使之具有先进性。

3、经济性原则：本标准编制过程，从获取信息、起草、实验室试验、

临床验证到形成征求意见稿的每一个环节，在确保质量的前提下均力行节

约，利用有限的经费圆满完成各阶段编写任务。

4、适用性原则：本标准借鉴国内外猪猪主要病毒性腹泻诊断、防控的

成功经验，并经本项目组的实验室和临床验证，完全按照要求编写，内容

全面，形式规范，可操作性和实用性强。

5、协调统一性原则：本标准参照国内相关标准的编写形式和表达方法，

力求与国内相关标准协调统一。本标准通过持续查新，确保内容不与已有

的国家、农业行业和地方标准相重复或矛盾。

6、规范化原则：本标准是严格按照GB/T1.1-2009的要求来编写的。

四、标准主要内容及依据

本标准是动物疫病防控推荐性地方标准，编写重点是疫病的诊断与防

控技术。标准的主要依据是借鉴国内先进标准和技术内容，参考国内外有

关文献资料，结合我国国情，进行实践研究，并通过实验室试验和临床验

3

证后提出。

标准编写主要内容包括诊断技术、结果判定、防控、管理制度、生物

安全和监测结果处置，适合于广西境内规模猪场猪主要病毒性腹泻的综合

防控。

标准的建立主要涉及以下两个试验：

（一）PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重RT-PCR检测方法的建立

1、材料与方法

1.1主要试剂

E.coliDH5α感受态细胞、MiniPlasmidKit质粒提取试剂盒购自天根

生化科技（北京）有限公司。MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit

Ver.4.0胶回收试剂盒、pMD18-T载体、EcoRⅠ内切酶、HindШ内切酶、

MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0核酸抽提试剂盒、

PrimeScriptTMⅡ1ststrandcDNASynthesisKit反转录试剂盒购自宝生物

工程（大连）有限公司。

1.2引物设计

根据GenBank上发表的PEDV（AF353511）、TGEV（DQ811789）、

PDCoV（JQ065042）、PRoV（FJ617209）参考毒株基因序列，设计特异

性引物（见表1），用于扩增PEDVN基因、TGEVM基因、PDCoVN基

因、PRoVVP6基因。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

表1PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV扩增引物

引物序列（5`→3`）目的基因产物大小/bp退火温度/℃

F:GCATTTCTACTACCTCGGAA

PEDV-NPEDVN75058.6

R:GCGATCTGAGCATAGCCTGA

F:GCGTCTGATTGTGAGTCATG

TGEV-MTGEVM54458.6

R:AATAGTCCTGCTGGGTAATG

F:GTCCCAGAGGAAATCTTAAGTATG

PDCoV-NPDCoVN18358.6

R:CTGGGCCATCTCCGGTTGGGAATC

F:CTTCGACATGGAGGTTCTGTACTC

PRoV-VP6PRoVVP632958.6

R:CATTTCGTTGCGATTCTCTAG

1.3重组质粒标准品的制备

4

取PEDVCV777株、TGEVH株、PDCoVGX1701株、PRoVNX株病

毒液，根据MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.4.0试剂盒使用说

明书提取总RNA，应用PrimeScriptTMⅡ1stStrandcDNASynthesisKit反

转录试剂盒进行反转录获得cDNA。以此为模板，应用设计的4对引物进

行PCR扩增。回收、纯化PCR产物，连接至pMD18-T载体、转化DH5α

感受态细胞，涂板，筛选阳性克隆并增菌培养，提取质粒，进行PCR、酶

切及测序鉴定。

1.4多重RT-PCR反应条件的优化

以构建的4种重组质粒标准品为模板，用设计的4对特异性引物在同

一反应体系中进行PCR扩增。建立总体积为25μL的四重PCR反应体系：

2×TaqPCRMasterMix12.5μL，4对特异性上、下游引物各0.5μL，4种重

组质粒标准品等比例混合物2.5μL，灭菌双蒸水补足至25μL。对PCR的

退火温度（分别为54.0℃、55.2℃、56.3℃、57.5℃、58.6℃、59.6℃）、

上下游引物的浓度（终浓度分别为0.125、0.25、0.375、0.50、0.625、0.75

pmol/μL）、循环数（分别为25、30、35、40、45个循环）等反应条件进

行优化。

1.5多重RT-PCR的特异性、敏感性、重复性试验

首先，以重组质粒标准品pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-N和

pPRoV-VP6，以及PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、FMDV、PRRSV和

CSFV的cDNA，PRV、PCV2和PPV的DNA作为模板，双蒸水作为阴性

对照，对所建立的多重RT-PCR进行特异性试验。其次，将上述4种重组

质粒标准品等比例混合后，10倍系列稀释成浓度为1.57×109~1.57×100拷

贝/μL，对所建立的多重RT-PCR进行敏感性试验。再次，随机选取同一个

浓度的4种重组质粒标准品等比例混合成1.57×107拷贝/μL，对所建立的

多重RT-PCR进行重复性试验。

1.6多重RT-PCR方法的临床应用

在广西各地发生腹泻的猪场中，采集病猪的粪便拭子、死亡仔猪的肠

5

道组织，共270份。应用所建立的多重RT-PCR方法检测PEDV、TGEV、

PDCoV、PRoV。

2结果

2.1重组质粒标准品的构建

提取PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV病毒液总RNA，反转录成cDNA

后作为模板，应用特异性引物进行PCR扩增，获得PEDVN基因750bp、

TGEVM基因544bp、PDCoVN基因183bp、PRoVVP6基因329bp等目

的片段。回收、纯化PCR产物，连接至pMD18-T载体、转化E.coliDH5α

感受态细胞，阳性克隆增菌培养后提取质粒。经PCR鉴定、酶切鉴定和测

序鉴定正确后，分别命名为pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-N、pPRoV-VP6。

鉴定结果见图1。

图1重组质粒pPEDV-N(A)、pTGEV-M(B)、pPDCoV-N(C)、pPRoV-VP6(D)鉴定

M：DNA分子质量标准；1：HindⅢ+EcoRⅠ酶切产物；2：PCR产物

6

2.2退火温度的优化

建立25μL多重PCR反应体系：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，4对

特异性上、下游引物（25pmol/μL）均为0.5μL，4种重组质粒标准品等比

例混合物2.5μL，双蒸水补足至25μL。反应程序：94℃预变性2min；94℃

变性10s，退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。其中，

退火温度分别设置为54.0、55.2、56.3、57.5、58.6和59.6℃。结果如图2

所示，各个退火温度均可获得较为清晰的扩增条带，最后选取58.6℃作为

最适退火温度。

图2多重RT-PCR退火温度的优化

M：DNA分子质量标准；1：54.0℃；2：55.2℃；3：56.3℃；4：57.5℃；5：58.6℃；6：59.6℃；

7：阴性对照

2.3引物浓度的优化

在25μL多重PCR反应体系中，固定退火温度为58.6℃，将4对特异

性上、下游引物终浓度以0.125、0.25、0.375、0.50、0.625和0.75pmol/μL

为6组不同的引物浓度，进行排列组合，其它条件固定不变，进行多重PCR，

以选出最佳引物浓度。经过优化，PEDV-N和PDCoV-N引物对的最佳终浓

度为0.50pmol/μL，TGEV-M和PRoV-VP6引物对的最佳终浓度为0.625

pmol/μL。部分结果见图3。

7

图3多重RT-PCR引物浓度的优化

M：DNA分子质量标准；1~6：PEDV、TGEV、PRoV引物终浓度分别固定为0.50、0.625、0.625pmol/μL，

PDCoV引物终浓度分别为0.125、0.25、0.375、0.50、0.625、0.75pmol/μL；7：阴性对照

2.4循环数的优化

建立25μL多重PCR反应体系，固定最佳退火温度和最佳引物浓度，

保持其它条件不变，将循环数分别设置为25、30、35、40和45个循环，

进行多重PCR。结果见图4，当循环数为35个时，扩增条带最清晰明亮，

确定为最佳循环数。

图4多重RT-PCR循环数的优化

M：DNA分子质量标准；1~5：循环数分别为25、30、35、40、45个；6：阴性对照

2.5多重RT-PCR反应条件的确定

经过优化反应条件，确定多重RT-PCR的反转录体系和PCR扩增体系。

8

20μL反转录体系：5×PrimeScriptⅡBuffer4μL，dNTPMixture（10

mmol/μL）1μL，随机引物6聚体（50μmol/μL）1μL、总RNA模板8μL，

RNA酶抑制剂（40U/μL）0.5μL，PrimeScriptⅡ反转录酶（200U/μL）1μL，

灭菌双蒸水4.5μL。反转录程序：30℃10min，48℃60min，95℃5min。

25μLPCR反应体系：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，PEDV-N和PDCoV-N

上、下游引物（25pmol/μL）0.5μL（终浓度均为0.50pmol/μL），TGEV-M

和PRoV-VP6上、下游引物（25pmol/μL）0.625μL（终浓度均为0.625

pmol/μL），cDNA2.5μL，灭菌双蒸水5.5μL。PCR扩增程序：94℃预变

性2min；94℃变性30s，58.6℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃

再延伸10min。

2.6多重RT-PCR特异性试验

分别以重组质粒pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-N和pPRoV-VP6，

以及PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、FMDV、PRRSV和CSFV的cDNA，

PRV、PCV2和PPV的DNA作为模板，灭菌双蒸水作为阴性对照，进行多

重RT-PCR反应。结果，只有PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV扩增出与

相应目的片段大小符合的条带，而FMDV、PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、

PPV均未出现扩增条带（见图5），表明多重RT-PCR没有交叉反应。

图5多重RT-PCR特异性试验

M：DNA分子质量标准；1：四种重组质粒混合物；2：PEDV；3：TGEV；4：PDCoV；5：PRoV；

6：FMDV；7：PRRSV；8：CSFV；9：PRV；10：PCV2；11：PPV；12：阴性对照

2.7多重RT-PCR敏感性试验

9

分别将pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-N和pPRoV-VP6重组质粒10

倍系列稀释成终浓度为1.57×109拷贝/μL~1.57×100拷贝/μL，进行单重PCR。

结果，pPEDV-N、pPDCoV-N、pPRoV-VP6的检出下限均为1.57×101拷贝

/μL，p-TGEV-M的检出下限为1.57×103拷贝/μL（见图6）。

图6单重RT-PCR敏感性试验

M：DNA分子质量标准；1~10：重组质粒浓度分别为1.57×109~1.57×100拷贝/μL；11：阴性对照

将pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-N和pPRoV-VP6重组质粒等比例

混合后，10倍系列稀释，使4种重组质粒的终浓度均为1.57×109拷贝

/μL~1.57×100拷贝/μL，进行多重PCR。结果，pPEDV-N、pPDCoV-N、

pPRoV-VP6的检出下限均为1.57×102拷贝/μL，pTGEV-M的检出下限为

1.57×103拷贝/μL（见图7）。

图7多重RT-PCR敏感性试验

M：DNA分子质量标准；1~10：重组质粒浓度分别为1.57×109~1.57×100拷贝/μL；11：阴性对照

10

2.8多重RT-PCR重复性试验

选取终浓度均为1.57×107拷贝/μL的4种重组质粒混合物作为模板，

固定其它条件不变，进行多重RT-PCR。结果，5次重复试验均能扩增出均

匀一致的目的条带，具有良好的重复性。

图8多重RT-PCR重复性试验

M：DNA分子质量标准；1~5：相同条件下的5次重复试验；6：阴性对照

2.9多重RT-PCR方法的临床应用

应用所建立的多重RT-PCR方法，对2017-2018年从广西各地采集的

270份腹泻病料进行检测。结果，PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV阳性分

别为42份（15.56%）、31份（11.48%）、29份（10.74%）、5份（1.85%），

其中PEDV阳性39份（14.45%），TGEV阳性28份（10.37%），PDCoV

阳性25份（9.26%），PRoV阳性3份（1.11%），PEDV和TGEV、PEDV

和PDCoV、PEDV和PRoV混合阳性各1份（0.37%），PDCoV和TGEV

混合阳性2份（0.74%），PDCoV和TGEV混合阳性1份（0.37%）（见

表2）。部分阳性病料的检测结果见图9。同时，按照国家标准《猪流行性

腹泻病毒RT-PCR检测方法》（GB/T34757-2017）、农业行业标准《猪传

染性胃肠炎病毒RT-nPCR检测方法》（NY/T2841-2015）、国家标准《猪

轮状病毒病RT-PCR检测方法》（GB/T34756-2017）、张帆帆报道的PDCoV

RT-PCR方法[15]，分别检测相应病料中的PEDV、TGEV、PRoV、PDCoV，

结果上述单重RT-PCR方法与本研究所建立的多重RT-PCR方法检测结果

11

的符合率为100%。随机选取PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV阳性样品各

3份，回收PCR产物，克隆、测序、比对，证实为相应病毒的基因片段。

表2临床病料检测结果

病原检测样品数（份）阳性样品数（份）阳性率（%）

PEDV2703914.45

TGEV2702810.37

PDCoV270259.26

PRoV27031.11

PEDV+TGEV27010.37

PEDV+PDCoV27010.37

PEDV+PRoV27010.37

PDCoV+TGEV27020.74

PDCoV+PRoV27010.37

合计Total27010137.41

图9部分临床样品检测结果

M：DNA分子质量标准；1：阴性对照；2：阳性对照；3~14：临床样品

（二）PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR

检测方法

1.1主要试剂和设备

MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0、TaKaRaRNAPCR

12

Kit(AMV)Ver.3.0（包含了RT-PCR扩增所需全部成份）、PremixEx

TaqTM(PerfectRealTime)（包含了荧光定量PCR反应所需的各种成分）为

宝生物工程（大连）有限公司。Q6型荧光定量PCR仪为ABI公司产品。

1.2引物和探针序列

表3PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV引物及探针序列

引物序列（5′→3′）目的基因产物大小/bp

PEDV-N-F5′-CTGGAATGAGCAAATTCGCTG-3′

PEDV-N-R5′-CTGAGGGTGTTTTCTGGGTTG-3′PEDV-N140

PEDV-N-PJOE-AGCGAATTGAACAACCTTCCAATTGGCA-BHQ1

TGEV-M-F5′-GCAATTCTTTGCGTTAGTGCAT-3′

TGEV-M-R5′-AGCGTACAAATTCCCTGAAAGC-3′TGEV-M102

TGEV-M-PTexasRed-CTTCCTCTCGAAGGTGTGCCAACTGG-BHQ2

PDCoV-M-F5′-ATCGACCACATGGCTCCAA-3′

PDCoV-M-R5′-CAGCTCTTGCCCATGTAGCTT-3′PDCoV-M72

PDCoV-M-P6-FAM-CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCT-BHQ1

PRoV-VP6-F5′-AATATGACACCAGCAGTTGCAAA-3′PRoV-VP6107

1.3样品来源

采集自广西各地发生腹泻的猪场，243份临床腹泻样品，包括腹泻仔猪

的粪便拭子、病猪和死亡仔猪的小肠及内容物。

1.4待检样品的处理与提取

无菌采取腹泻仔猪的粪便拭子、病猪和死亡仔猪的小肠及内容物等共

约1g，置于2.0mL离心管中，加入灭菌的1mol/LPBS（pH7.2）1mL，

用组织匀浆机充分研磨后，反复冻融3次；细胞培养物则直接反复冻融3

次。以10000×g离心5min，收集上清，用于总RNA抽提，或置-20℃

保存备用。按照RNA/DNA抽提试剂盒说明书抽提总RNA后，反转录为

cDNA。获得的cDNA置-20℃保存备用。

1.5重组质粒标准品的制备

取PEDVCV777株、TGEVH株、PDCoVGX1701株、PRoVNX株

病毒液抽提总RNA并反转录成cDNA，应用设计的4对引物进行PCR扩

增。回收、纯化PCR产物，连接至pMD18-T载体、转化DH5α感受态细

13

胞，涂板，筛选阳性克隆并增菌培养，提取质粒，进行PCR、酶切及测序

鉴定。经鉴定正确的阳性重组质粒作为标准品，分别命名为p-PEDV-N、

p-TGEV-M、p-PDCoV-M、p-PRoV-VP6。应用核酸蛋白分析仪测定浓度，

计算拷贝数。拷贝数=质粒浓度×6.02×1023/（660×质粒总长度）。

1.6反应条件的优化和标准曲线的制作

将4种重组质粒标准品p-PEDV-N、p-TGEV-M、p-PDCoV-M、

p-PRoV-VP6作为模板，应用4对特异性引物和TaqMan探针，在同一反应

体系中进行多重TaqMan荧光定量PCR扩增，优化各种反应条件。扩增反

应中，当Ct值≤35循环时判为阳性反应。建立总体积为25μL的多重反应

体系，分别对退火温度（52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃）、引物

浓度（终浓度为0.2pmol/μL、0.3pmol/μL、0.4pmol/μL、0.5pmol/μL）和

探针浓度（终浓度为0.2pmol/μL、0.3pmol/μL、0.4pmol/μL、0.5pmol/μL）

进行优化，以获得TaqMan荧光定量PCR的最佳反应条件。

将4种重组质粒标准品10倍系列稀释成2.06×109/μL~2.06×103拷贝

/μL，作为模板，按照优化的TaqMan荧光定量RT-PCR反应条件进行扩增，

绘制扩增曲线及标准曲线。

1.7特异性试验

取PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PRRSV、CSFV和FMDV病毒液，

按照RNA/DNA抽提试剂盒说明书抽提总RNA并反转录成cDNA；取

PCV2、PPV和PRV病毒液，按照RNA/DNA抽提试剂盒说明书抽提总

DNA。以cDNA和DNA为模板，双蒸水作为阴性对照，对所建立的多重

TaqMan荧光定量RT-PCR进行特异性试验。

1.8敏感性试验

将4种重组质粒标准品p-PEDV-N、p-TGEV-M、p-PDCoV-M、

p-PRoV-VP6进行10倍系列稀释，选取终浓度为2.06×109~2.06×100拷贝/μL

的质粒等比例混合物作为模板，进行TaqMan荧光定量PCR扩增，检验其

敏感性。

14

1.9重复性试验

将4种重组质粒p-PEDV-N、p-TGEV-M、p-PDCoV-M、p-PRoV-VP6

分别10倍系列稀释后等比例混合，取3个浓度梯度（终浓度分别为

2.06×108、2.06×106、2.06×104拷贝/μL）质粒混合物，进行组内和组间重

复性试验。组间重复性试验间隔1周进行。

1.10临床样品检测

从广西各地2018年发生腹泻的猪场采集腹泻病猪和死亡仔猪的肠道

组织以及病猪的粪便拭子共243份，应用上述的本实验室之前建立的多重

RT-PCR方法以及本研究所建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法进

行检测，并比较两者检测PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV结果的符合率。

2结果

2.1重组质粒标准品的构建

提取PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV病毒液总RNA，反转录成cDNA

后作为模板，应用特异性引物进行PCR扩增，获得PEDVN基因（140bp）、

TGEVM基因（102bp）、PDCoVM基因（72bp）、PRoVVP6基因（107

bp）片段，与各自目的片段大小一致。经回收、连接、转化，阳性克隆提

取质粒，进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定，成功构建了4种重组质粒，

分别命名为p-PEDV-N、p-TGEV-M、p-PDCoV-M、p-PRoV-VP6，并将其

作为标准品。

2.2多重TaqMan荧光定量RT-PCR反应条件的确定

经过优化，获取多重TaqMan荧光定量RT-PCR的最佳反应条件。25μL

反应体系为：PremixExTaqTM(ProbeqPCR)12.5μL，PEDV-N和

PRoV-VP6上、下游引物（25pmol/μL）及探针（25pmol/μL）各0.5μL（终

浓度均为0.50pmol/μL），TGEV-M和PDCoV-M上、下游引物（25pmol/μL）

及探针（25pmol/μL）各0.3μL（终浓度均为0.30pmol/μL），模板2μL，

灭菌双蒸水5.7μL。扩增程序为：95℃20s；95℃1s，58℃45s，40个循

环，同时收集荧光信号。

15

2.3多重TaqMan荧光定量RT-PCR标准曲线的绘制

将p-PEDV-N、p-TGEV-M、p-PDCoV-M和p-PRoV-VP6质粒标准品

10倍系列稀释成2.06×109~2.06×103拷贝/μL，等比例混合后作为模板进行

扩增，获得多重TaqMan荧光定量RT-PCR的扩增曲线和标准曲线（图10）。

结果显示，4种标准曲线的相关系数（R2）均在0.998以上，表明各种标准

品的起始模板数和Ct值之间呈现良好的线性关系。

A:B:

PEDVTGEV

C:D:

PDCoVPRoV

1

2

3

4

E

(A-D)1-7:2.06×109-2.06×103copies/μL

(E)1:PEDV:y=-3.094x+34.314,R2=0.998;2:TGEV:y=-3.554x+38.423,R2=0.998;3:PDCoV:

y=-3.216x+35.024,R2=0.999;4:PRoV:y=-3.108x+35.395,R2=0.998

图10多重TaqMan荧光定量RT-PCR的扩增曲线（A、B、C、D）及标准曲线（E）

16

2.4特异性分析

以PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PRRSV、CSFV、FMDV的cDNA

和PCV2、PPV和PRV的DNA为模板，以灭菌双蒸水为阴性对照，对所

建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR进行特异性验证。结果显示，只有

作为阳性对照的p-PEDV-N、p-TGEV-M、p-PDCoV-M、p-PRoV-VP6质粒

标准品以及以PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的cDNA为模板的反应出

现特异性扩增曲线，而且Ct值均小于35个循环，其余病毒的cDNA或DNA

为模板以及阴性对照均无扩增曲线（图11）。表明，所建立的多重TaqMan

荧光定量RT-PCR方法与其它病毒没有交叉反应，具有较强的特异性。

1

5678910

21′

4′3′

32′

4

1:p-TGEV-M;2:p-PEDV-N;3:p-PDCoV-M;4:p-PRoV-VP6;1′:TGEV;2′:PEDV;3′:PDCoV;4′:

PRoV;5:PRRSV;6:CSFV;7:FMDV;8:PCV2;9:PPV;10:PRV

图11多重TaqMan荧光定量RT-PCR特异性试验的扩增曲线

2.5敏感性分析

将p-PEDV-N、p-TGEV-M、p-PDCoV-M和p-PRoV-VP6质粒标准品

10倍系列稀释成2.06×109~2.06×100拷贝/μL，等比例混合后作为模板，进

行多重TaqMan荧光定量PCR的敏感性试验。扩增反应中，当Ct值≤35

循环时判为阳性反应。结果显示，p-PDCoV-M检出下限为2.06×101拷贝

/μL，p-PEDV-N、p-TGEV-M检出下限为2.06×102拷贝/μL，p-PRoV-VP6

17

检出下限为2.06×103拷贝/μL（图12）。表明，该方法具有良好的敏感性。

A:PEDVB:TGEV

C:PDCoVD:PRoV

1-10:2.06×109-2.06×100copies/μL

图12多重TaqMan荧光定量RT-PCR敏感性试验的扩增曲线

2.6重复性分析

将4种质粒标准品p-PEDV-N、p-TGEV-M、p-PDCoV-M和p-PRoV-VP6

系列稀释后等比例混合，选取3个浓度梯度（终浓度分别为2.06×108、

2.06×106、2.06×104拷贝/μL)，对所建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR

进行重复性测定。结果显示，组内及组间重复性试验Ct值的变异系数均小

于1.1%，表明该方法具有良好的重复性（表4）。

18

表4多重TaqMan荧光定量RT-PCR的重复性分析

浓度组内重复试验Ct值组间重复试验Ct值

质粒标准品

平均值标准差变异系数平均值标准差变异系数

MeanSDCV%MeanSDCV%

1.0×10429.270.030.1029.420.100.35

p-PEDV-N1.0×10622.600.100.4422.250.150.66

1.0×10816.290.030.1816.200.060.39

1.0×10431.050.100.3231.170.160.50

p-TGEV-M1.0×10624.800.271.0924.390.261.06

1.0×10818.090.040.2218.040.100.56

1.0×10429.500.180.6129.480.160.50

p-PDCoV-M1.0×10622.890.100.4422.670.170.76

1.0×10816.300.080.4916.370.100.59

1.0×10429.830.060.2030.520.100.37

p-PRoV-VP61.0×10624.420.160.6623.690.200.86

1.0×10817.190.120.7017.210.110.64

2.7临床样品的检测结果

应用所建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法，对2018年采集自

广西各地的243份临床腹泻病料进行检测。结果显示，能够检出PEDV、

TGEV、PDCoV、PRoV一种或多种病原的阳性样品96份（42.