园艺植物生物技术第四章

Plantcellengineering应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的试验方法和技术，在细胞水平上研究改造园艺植物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或园艺植物新品种的科学。现在是1页\一共有59页\编辑于星期二现在是2页\一共有59页\编辑于星期二MaincontentsPlantcellcultureProtoplastIsolationandFusion现在是3页\一共有59页\编辑于星期二1.

Plantcellculture

Haberlandt(Austria): Cultivateisolatedplantcells

invitroonanartificialmedium--->现在是4页\一共有59页\编辑于星期二Concept：

指对植物器官或愈伤组织上分离出来的单细胞(或小细胞团)进行培养，形成单细胞无性系或再生植物的技术。Significance：（1）研究细胞生理代谢过程及各种影响因子；（2）用于植物品种的改良；（3）用于植物次生代谢物质的生产。现在是5页\一共有59页\编辑于星期二1.1.1Isolationofsinglecella.Isolationofsinglecellfromleafdirectly（1）mechanicalmethod：研磨→过滤，离心→细胞纯化（2）enzymolysismethod：果胶酶、膜稳定剂、渗透压调节剂硫酸葡聚糖钾甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等1.1Singlecellculture

现在是6页\一共有59页\编辑于星期二Basicproceduresofenzymolysismethod取叶片，表面消毒撕掉下表皮，切成小块加入酶解液（0.5%果胶酶+0.8%甘露醇+1%硫酸葡聚糖钾）摇床上保温培养现在是7页\一共有59页\编辑于星期二b.

Isolationofsinglecellfromcallustissue（1）离体器官（2）愈伤组织（3）继代培养2个月（4）转至液体培养基震荡培养（5）悬浮细胞（6）无菌过滤，离心（7）单细胞现在是8页\一共有59页\编辑于星期二 对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，直到长成完整植株的技术。

1.1.2Methodsofsinglecellculture现在是9页\一共有59页\编辑于星期二CulturemethodsPlateculture平板培养Nurseculture看护培养Microculture微室培养Conditionedmediumculture条件培养基培养现在是10页\一共有59页\编辑于星期二a.Plateculture:分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。

方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶等)消化分散纯化的细胞，经计数及稀释，接种到加热熔化而刚冷却至35℃左右的固体培养基中充分混匀，倾入培养皿中，石蜡密封，于25℃培养，约20天后细胞即可生长成团。统计生长情况。现在是11页\一共有59页\编辑于星期二现在是12页\一共有59页\编辑于星期二现在是13页\一共有59页\编辑于星期二现在是14页\一共有59页\编辑于星期二b.Nurseculture：

从悬浮培养物或脆弱愈伤组织上用针或玻璃毛细管分离单细胞，每个细胞放在一个方形滤纸片的上表面，而滤纸片放在活跃生长的愈伤组织上进行培养的方法。现在是15页\一共有59页\编辑于星期二c.Microculture:悬浮单细胞接种于凹玻片或玻璃环与盖玻片组成的微室内的固体培养基中的培养方法。现在是16页\一共有59页\编辑于星期二1.1.3Influencingfactorsofsinglecellculturea.

Medium：特殊成分，植物激素，pHb.Celldensity：平板临界密度103个/mLc.Environmentalconditions

：25℃，1%CO2现在是17页\一共有59页\编辑于星期二1.2.cellsuspensionculture细胞的悬浮培养是指将游离的植物细胞按一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养的方法。适宜于大规模培养，细胞工程产业的技术基础.现在是18页\一共有59页\编辑于星期二1.2.1Proceduresofcellsuspensionculture

愈伤组织

1g愈伤/10ml培养基150、250ml三角瓶（30、70ml培养基）120rpm,25℃黑暗培养,换液1次/3d以防粘稠蔗糖梯度离心或过滤法(淘汰过大或生理状态不好的细胞团)继代培养80rpm（悬浮细胞系稳定以后）继代时间为1周时（原悬浮液：新培养基=1：4）悬浮愈伤组织形成及植株再生现在是19页\一共有59页\编辑于星期二愈伤组织要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。适于悬浮培养适于再生植株现在是20页\一共有59页\编辑于星期二

a.Batchculture分批培养

分批培养是在一个封闭的系统中进行细胞培养，当培养物增加到一定量时，需继代培养，即取出少量培养物转接于新鲜培养液中。

1.2.2Typesofcellsuspensionculture

现在是21页\一共有59页\编辑于星期二Thecellsincultureexhibitthefollowingfivephasesofagrowthcyclei.Lagphase,wherecellspreparetodivide.ii.Exponentialphase,wheretherateofcelldivisionishighest.iii.Linearphase,wherecelldivisionslowsbuttherateofcellsexpansionincreases.iv.Decelerationphase,wheretheratesofcelldivisionandelongationdecreases.v.Stationaryphase,wherethenumberandsizeofcellsremainconstant.现在是22页\一共有59页\编辑于星期二b.Semi-continuousculture半连续培养

是利用培养罐等装置进行细胞大量培养的一种方式。在半连续培养时，当培养容器内细胞增殖到一定数量后，倒出一半细胞悬浮液于另一培养罐等容器，再分别加入新鲜培养基继续培养。半连续培养能够重复获得大量均一的培养细胞供进一步利用。现在是23页\一共有59页\编辑于星期二c.Continuousculture连续培养

是用一定容积的非密闭系统进行细胞培养的方法，在培养过程中不断注入新鲜培养基，而使营养物连续得到补充，细胞生长和增殖连续进行，同时有等体积的培养物排除系统。

Opencontinuousculture开放型Closedcontinuousculture封闭型现在是24页\一共有59页\编辑于星期二1.2.3Requirementsforgoodsuspensionculturesystema.悬浮培养物分散性好，细胞团较小，一般由几十个以下的细胞组成。b.均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。c.生长迅速，悬浮细胞的量一般2-3天甚至更短时间便可增加一倍。现在是25页\一共有59页\编辑于星期二1.3ApplicationofcellcultureProductionofsecondarymetabolites

辣椒素、花青素Selectionofmutant突变体的选择Polyploidinducement诱导多倍体生产人工种子现在是26页\一共有59页\编辑于星期二2.ProtoplastIsolationandFusion

原生质体的游离与融合现在是27页\一共有59页\编辑于星期二2.1.ProtoplastIsolation

Methodsmechanicalmethodsenzymaticmethods现在是28页\一共有59页\编辑于星期二现在是29页\一共有59页\编辑于星期二MechanicalmethodApplicationrangelargeandhighlyvacuolatedcellsofstoragetissuesonionbulbscales,radishrootandbeetroottissue现在是30页\一共有59页\编辑于星期二Disadvantages(i)Itisrestrictedtocertaintissueswhichhavelargevacuolatedcells.(ii)Yieldofprotoplastsisgenerallyverylow.Protoplastsfromlessvacuolatedandhighlymeristematiccellsdonotshowgoodyield.(iii)Themethodistediousandlaborious.(iv)Viabilityofprotoplastsislowbecauseofthepresenceofsubstancesreleasedbydamagedcells.现在是31页\一共有59页\编辑于星期二2.1.2EnzymaticmethodCocking在1960年证实了用酶从高等植物中分离出原生质体的可能性。Cockingin1960demonstratedthepossibilityofenzymaticisolationofprotoplastsfromhigherplants.现在是32页\一共有59页\编辑于星期二Influencingfactors(1)PhysiologicalstateoftissueandcellmaterialProtoplastshavebeenisolatedfromavarietyoftissuesandorgansincludingleaves,petioles,shootapices,roots,fruits,coleoptiles,hypocotyls,stem,embryos,microspores,callusandcellsuspensionculturesofalargenumberofplantspecies.

分离材料包括叶片、叶柄、芽尖、根、果实、胚芽鞘、胚轴、茎、胚芽、花粉粒、愈伤组织和细胞悬浮培养物等。植物幼苗或新生枝的完全伸展叶片的叶肉组织是分离原生质体的最方便、最合适的植物材料。现在是33页\一共有59页\编辑于星期二(2)

EnzymesThereleaseofprotoplastsisverymuchdependentonthenatureandcompositionofenzymesusedtodigestthecellwall.原生质体的释放在很大程度上取决于用于消化细胞壁的酶的性质和组成。现在是34页\一共有59页\编辑于星期二Threeprimarycomponentsofthecellwall:cellulose,hemicelluloseandpectinsubstances.细胞壁主要成分:纤维素、半纤维素和果胶类物质。Celluloseandhemicelluloses:thecomponentsofprimaryandsecondarystructureofcellwallPectin:acomponentofmiddlelamellathatjoinsthecells.纤维素和半纤维素是细胞壁初生结构和次生结构的成分，而果胶类物质是连接细胞的胞间层的成分。现在是35页\一共有59页\编辑于星期二Pectinase:mainlydegradesthemiddlelamellaCellulaseandhemicellulase:digestthecellulosicandhemicellulosiccomponentsofthecellwall,respectively.果胶酶主要是降解中层，而纤维素酶和半纤维素酶分别用于消化细胞壁的纤维素和半纤维素成分。

现在是36页\一共有59页\编辑于星期二现在是37页\一共有59页\编辑于星期二TheactivityoftheenzymeispHdependentandisgenerallyindicatedbythemanufacturer.pH:4.7-6.0.Temperature:25-30℃Treatmenttime:30min-20h现在是38页\一共有59页\编辑于星期二(3)Osmoticum渗透剂Protoplastsreleaseddirectlyintostandardcellculturemediumwillburst.Hence,inisolatingprotoplasts,thewallpressurethatismechanicallysupportedbycellwallmustbereplacedwithanappropriateosmoticpressureintheprotoplastisolationmixtureandalsolaterintheculturemedium.原生质体直接释放到标准培养基中会破裂，因此，在分离原生质体期间，对原来由细胞壁机械维持的压力用原生质体分离混合液以及后来培养基的适当渗透压代替。

现在是39页\一共有59页\编辑于星期二低(或负)渗透势常是由于加入各种离子或非离子型溶质产生的。

Non-ionicsubstances非离子型物质:carbohydrates,mannitol,sorbitol,glucose,fructose,galactoseorsucrose.Ionicsubstances离子型物质:KCl、CaCl2,MgSO4最常用的渗透剂:Mannitol,sorbitol现在是40页\一共有59页\编辑于星期二

(4)Protoplastpurification原生质体的纯化

酶消化后得到的混合物含有亚细胞碎片、未消化的细胞、破碎的和完好的原生质体。对这个混合物通过过滤(filtration)、离心(centrifugation)和漂洗(washing)联合的方法进行纯化。现在是41页\一共有59页\编辑于星期二(5)Protoplastviabilityanddensity原生质体的活力和密度

Methods:①

Fluoresceindiacetate(FDA)stainingmethod荧光素二乙酸(FDA)染色法：FDA是一种积累在活原生质体质膜中的染料，能被荧光显微镜检测出来。当在细胞膜中积累荧光素二乙酸时，5min内活的、完整的原生质体就发出黄绿色光。现在是42页\一共有59页\编辑于星期二②Phenosafraninestaining酚藏花红染色法：使用酚藏花红时的终浓度为0.01％，它只能使无生命力的原生质体被染成红色，活的原生质体不能被酚藏花红染色。③CalcofluorWhite(CFW)staining荧光增白剂(CFW)染色法④ExclusionofEvansbluedyebyintactmembranes完整细胞膜的排斥Evans蓝染料法现在是43页\一共有59页\编辑于星期二⑤Observationsoncyclosisorprotoplaststreamingasameasureofactivemetabolism观察胞质环流法检测有活力的代谢⑥Variationofprotoplastsizewithosmoticchanges随渗透改变的原生质体体积变化⑦Oxygenuptakemeasuredbyanoxygenelectrodewhichindicatesrespiratorymetabolism用氧电极测放氧从而检测代表活力的呼吸代谢⑧Photosyntheticstudies光合作用研究现在是44页\一共有59页\编辑于星期二(6)CulturetechniquesAgarculture琼脂培养法

Liquidculture液体培养法

Liquiddropletmethod小液滴培养法

Hangingdropletmethod悬滴培养法

Feederlayer饲喂层法

Co-culturing联合培养法现在是45页\一共有59页\编辑于星期二

(7)Culturemedium培养基成分培养原生质体和培养植物细胞的营养需要是极其相似的。用于培养植物细胞的矿质盐的成分已经被调整到使之满足培养原生质体的特殊需要。甘露醇和山梨糖醇是用于维持渗透压最常用的化合物现在是46页\一共有59页\编辑于星期二

(8)Environmentalfactors环境因子在黑暗中或微弱光下先培养几天，然后再将培养物转移到约2000～50001x的光强下培养。原生质体培养的一般温度范围是20～28℃，建议原生质体培养基的pH范围是5．5～5．9，这个pH范围的培养效果看起来很好。现在是47页\一共有59页\编辑于星期二2.2Protoplastdevelopment

原生质体发育2.2.1Cellwallformation细胞壁形成2.2.2Growth,divisionandplantregeneration

生长、分裂和植株再生现在是48页\一共有59页\编辑于星期二2.3Somatichybridization

体细胞杂交Concept离体条件下，通过分离的体细胞原生质体融合产生杂合体，再通过其异核体的发育形成杂种植株的技术被称为体细胞杂交。体细胞杂交包含原生质体融合（fusionofprotoplasts）、杂种细胞的选择（selectionofhybridcells）、杂种植株的鉴定（identificationofhybridplants）现在是49页\一共有59页\编辑于星期二原生质体融合是基因组不同的两个原生质体的融合，可以通过自发融合（spontaneousfusion）和诱导融合（inducedfusion）的方法实现。2.3.1Protoplastfusion原生质体融合现在是50页\一共有59页\编辑于星期二(1)

Spontaneousfusionmethod自然融合法

(2)

Inducedfusionmethod诱导融合法①Treatmentwithsodiumnitrate硝酸钠处理法②CalciumionsathighpH高pH钙离子③Polyethyleneglycolmethod聚乙二醇法④Electrofusion电融合现在是51页\一共有59页\编辑于星期二现在是52页\一共有59页\编辑于星期二原生质体融合产物的鉴定和恢复是基于对一般可见特征的观察，杂种细胞显示出隐性突变的遗传互补和体外生长要求的生理学互补。2.3.2Identifi