合成生物第3部分农业作物抗逆性基因编辑策略

1合成生物第3部分：农业作物抗逆性基因编辑策略本文件规定了农业作物抗逆性基因编辑策略的技术要求、试验方法。适用于水稻、小麦、玉米等主要农作物的抗逆性基因编辑技术研发与应用，其他作物可参照执行。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T191包装储运图示标志GB/T3543.3农作物种子检验规程净度分析GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验GB/T3543.7农作物种子检验规程其他项目检验GB/T5009.124食品中氨基酸的测定GB/T26792高效液相色谱仪GB/T27404实验室质量控制规范食品理化检测GB/T34265Sanger法测序技术指南GB/T35535大豆、油菜中外源基因成分的测定膜芯片法GB/T37969近红外光谱定性分析通则GB/T38571植物次生代谢物生物碱的检测液相色谱-质谱法GB/T39917主要农作物品种真实性和纯度SSR分子标记检测稻YY/T0588流式细胞仪YY/T1261HER2基因检测试剂盒（荧光原位杂交法）YY/T1865BRCA基因突变检测试剂盒及数据库通用技术要求（高通量测序法）NY/T2483植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南冰草属NY/T2745水稻品种真实性鉴定SNP标记法NY/T4021小麦品种真实性鉴定SNP标记法NY/T4022玉米品种真实性鉴定SNP标记法3术语和定义GB/T27404、GB/T3543.3、GB/T3543.4、GB/T3543.7界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1农业作物抗逆性resistanceofagriculturalcrops农业作物在面对不利环境条件（干旱、盐碱、高温、低温、病虫害）时，能够维持正常生长发育和产量稳定的能力。3.2抗逆性基因编辑reverse-resistancegeneediting通过CRISPR/Cas9技术定向修饰作物基因组，增强其对干旱、盐碱、病虫害等逆境胁迫的耐受性。24技术要求4.1基因编辑靶点设计靶序列长度应为18bp～23bp（bp表示碱基对GC含量40%～60%(GC表示鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比例)，避免连续4个以上相同碱基重复，且需通过生物信息学工具预测脱靶风险，脱靶概率应小于等于0.1%。4.2编辑效率要求基因编辑的效率应达到一定水平，基因编辑效率分级要求见表1要求。其中基因敲除效率大于等于70%；基因插入效率大于等于50%。表1基因编辑效率分级要求ABC4.3安全性检验抗逆性基因编辑的安全性检验要求见表2。表2抗逆性基因编辑的安全性检验注：检测限（LOD）是指在特定检测方法中，能够可靠检测到目标物质（如核酸、蛋白、P值是假设检验中的概率值，表示观察到的结果由随机误差5试验方法5.1基因编辑效率检测用PCR和测序相结合的方法检测基因编辑效率。检测步骤如下：a）首先，提取转基因植株的基因组DNA，以特异性引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，观察是否有预期大小的编辑产物条带；b）然后，对阳性条带进行测序，比对序列结果，确定编辑位点和编辑类型（插入、缺失、替换统计编辑植株的数量和比例；c）计算编辑效率。35.2脱靶效应检测采用全基因组测序技术对编辑植株进行脱靶效应检测。检测步骤如下：a）首先，提取高质量的基因组DNA，构建测序文库，进行高通量测序；b）然后，将测序数据与参考基因组进行比对分析，寻找与sgRNA序列具有较高相似性的潜在脱靶位点，并进一步验证这些位点是否存在编辑痕迹；c）使用专业的生物信息学软件和工具进行数据分析。5.3抗逆性表型试验将编辑后的植株在模拟的逆境条件下进行培养，干旱、盐碱、高温、低温、病虫害，观察其生长发育状况、形态特征、生理指标等，与