RNA的生物合成-转录讲课文档

RNA的生物合成-转录第1页，共54页。基因(gene)：基因是负责编码一个RNA的一段DNA序列。对于编码蛋白质的基因，该RNA进而编码产生一种蛋白质。启动子（Promoter）：一段能够被RNA聚合酶识别并结合的DNA序列，它决定着基因是否转录及转录的强度。转录起始位点（Startpoint）：RNA转录合成起始处所对应的DNA分子上的碱基对。用+1表示。上游（Upstream）和下游：转录起始位点的5’-端，称为上游，上游单核苷酸的位置用-10、-35等表示。而在其3’-端称为下游，下游单核苷酸的位置用+10、+100等表示。终止子（Terminator）：一段能够引起RNA聚合酶终止合成RNA的DNA序列。1.一些重要的概念第2页，共54页。AtranscriptionunitisasequenceofDNAtranscribedintoasingleRNA,startingatthepromoterandendingattheterminator.第3页，共54页。转录单位（transcriptionunit）：从转录起始位点到终止位点的一段DNA，或能够被转录成一个RNA分子的一段DNA，称为一个转录单位。一个转录单位可以包含1个或几个基因。单顺反子（monocistron）：一条mRNA只代表一个基因，称为单顺反子。多顺反子（polycistron）：很多情况下，一个mRNA分子中含有多个基因，称为多顺反子。初始转录物（Primarytranscript—precursor)：刚刚转录产生、未经任何形式加工的RNA，称为初始转录物。第4页，共54页。模板链（templatestrand）：DNA双链中，按照碱基互补配对原则指导合成RNA的一条链。又称反义链。编码链（Codingstrand）：DNA双链中，与模板链互补的另一条链，称为编码链。又称有意义链。第5页，共54页。2.转录的一般特点（1）以DNA为模板酶促合成RNA

细胞内RNA的生物合成过程是一个酶促反应过程，参与该过程的酶是RNA聚合酶（RNApolymerase）。此酶必须以双链DNA中的一条链（或单链DNA）为模板，按照碱基配对原则，将NTP以3′,5′-磷酸二酯键的方式聚合起来，催化合成与模板互补的RNA。（2）DNA双链中只有一条链被转录成RNA—转录的不对称性。（3）RNA的合成方向：5′→3′。

（4）转录的起始不需要引物，RNA聚合酶无校正功能。第6页，共54页。3.转录过程共包括4步：1）Templaterecognition模板识别2）Initiation起始3）elongation延伸4）Termination终止第7页，共54页。Transcriptionhasfourstages,whichinvolvedifferenttypesofinteractionbetweenRNApolymeraseandDNA.TheenzymebindstothepromoterandmeltsDNA,remainsstationaryduringinitiation,movesalongthetemplateduringelongation,anddissociatesattermination.MCB1.识别2.起始3.延伸4.终止第8页，共54页。4.转录的主要产物

messengerRNA(mRNA)transferRNA(tRNA)ribosomalRNA(rRNA)

AnmRNAistranslatedintoaproteinsequence;tRNAandrRNAprovideothercomponentsoftheapparatusforproteinsynthesis.第9页，共54页。§5-2原核生物基因的转录1.RNA聚合酶（RNApolymerase）

以DNA为模板合成RNA的聚合酶。又称为DNA依赖的RNA聚合酶。大肠杆菌RNA聚合酶：

全酶（holoenzyme）:α2ββ′σ

核心酶（coreenzyme）:α2ββ′sigmafactor:theσpolypeptide.

σ因子能够使细菌RNA聚合酶稳定地结合在启动子上。只有全酶能够起始转录。第10页，共54页。Theαsubunitplaysaroleinpromoterrecognition.TheαsubunitalsoplaysaroleintheinteractionofRNApolymerasewithsomeregulatoryfactors.Theβandβ′subunitstogethermakeupthecatalyticcenter;TheβsubunitcanbecrosslinkedtothetemplateDNA,theproductRNA,andthesubstrateribonucleotides;SigmafactoristhesubunitofbacterialRNApolymeraseneededforinitiation;Itisthemajorinfluenceonselectionofbindingsites(promoters).第11页，共54页。起始时RNA聚合酶结合在-55to+20区.当σ亚基脱离后核心酶向下游收缩至-30.当核心酶向下游移动一些碱基对后，形成延伸复合物，开始了RNA的合成。第12页，共54页。AsingletypeofRNApolymeraseappearstoberesponsibleforalmostallsynthesisofmRNA,andallrRNAandtRNA,inaeubacterium.由同一种RNA聚合酶合成所以的细菌RNA（mRNA、tRNA、rRNA）。About7000RNApolymerasemoleculesarepresentinanE.colicell.Probably2000~5000enzymesaresynthesizingRNAatanyonetime,thenumberdependingonthegrowthconditions.每个细菌细胞内含有打印7000个RNA聚合酶分子。其中2000~5000个在工作，具体数量由生长条件决定。a,b,andb’亚基的大小恒定，而δ亚基大小有较大的变化。第13页，共54页。第14页，共54页。ControlsitesinDNAprovidebindingsitesforproteins;codingregionsareexpressedviathesynthesisofRNA.

2.PromoterandInitiation启动子与转录起始第15页，共54页。1）原核生物基因的启动子有4个结构特征Fourconservedfeaturesinabacterialpromoter:Startpoint转录起始位点;-10sequence-10序列;-35sequence-35序列;-10and-35序列之间的间隔序列。第16页，共54页。startpoint转录起始位点它通常是嘌呤单脱氧核苷酸(>90%)，其通用的核心序列是CAT,但该三联体的保守性还不足以完全能够进行转录起始。-10sequence

(Pribnowbox）其保守序列是

TATAAT（6bp），位于转录起始位点的上游-18to-9.第17页，共54页。-35sequence（Sextamabox):核心序列是TTGACA.其中心位于转录起始位点上游约~35bp处。-10and-35序列之间的间隔序列：在90%的原核基因启动子中，长为16-18bp，很少有小于15bp或大于20bp的.Althoughtheactualsequenceintheinterveningregionisunimportant,thedistanceiscriticalinholdingthetwositesattheappropriateseparationforthegeometryofRNApolymerase.尽管此间隔的序列不重要，但其长短对于RNA聚合酶在空间上的准确识别是重要的。第18页，共54页。在生物进化过程中，形成了不同的σ因子。不同的σ因子可以帮助RNA聚合酶识别不同的启动子序列。

E.colisigmafactorsrecognizepromoterswithdifferentconsensussequences.(Numbersinthenameofafactorindicateitsmass.)第19页，共54页。3.Elongation延伸RNA的合成—转录是在转录泡中进行的。转录泡即暂时打开的DNA双链（17bp），RNA聚合酶以其中的一条链—模板链为模板，按照碱基配对原则合成RNA。Transcriptiontakesplaceinabubble,inwhichRNAissynthesizedbybasepairingwithonestrandofDNAinthetransientlyunwoundregion.随着转录泡的前移，后方的DNA重新形成双链，将单链RNA释放出去。Asthebubbleprogresses,theDNAduplexreformsbehindit,displacingtheRNAintheformofasinglepolynucleotidechain.

第20页，共54页。Duringtranscription,thebubbleismaintainedwithinbacterialRNApolymerase,whichunwindsandrewindsDNA,maintainstheconditionsofthepartnerandtemplateDNAstrands,andsynthesizesRNA.第21页，共54页。4.Termination终止TerminatorisasequenceofDNA,representedattheendofthetranscript,thatcausesRNApolymerasetoterminatetranscription.BacterialRNApolymerasehastwomodesoftermination.细菌RNA聚合酶的终止有两种方式。第22页，共54页。根据RNA聚合酶的终止是否需要其他因子的参与，将终止子分为2种。1）内部终止子。不需要其他因子的帮助。Coreenzymecanterminateinvitroatcertainsitesintheabsenceofanyotherfactor.Thesesitesarecalledintrinsic（固有的，内在的）terminators.

2）依赖于Rho(ρ)因子的终止子。ρ-dependentterminatorsaredefinedbytheneedforadditionofρfactorinvitro.

factorisanessentialproteininE.coli.Itfunctionssolelyatthestageoftermination.Itisa~275kDahexamerofidenticalsubunits.Itfunctionsasanancillary(辅助的)factorforRNApolymeraseIthasNTPaseactivity.第23页，共54页。Intrinsicterminatorsincludepalindromicregionsthatformhairpinsvaryinginlengthfrom7-20bp.Thestem-loopstructureincludesaG-C-richregionandisfollowedbyarunofUresidues.Intrinsicterminators:第24页，共54页。A

-dependentterminatorhasasequencerichinCandpoorinGprecedingtheactualsite(s)oftermination.Rho-dependentterminators:第25页，共54页。

factorpursuesRNApolymerasealongtheRNAandcancauseterminationwhenitcatchestheenzymepausingata

-dependentterminator.第26页，共54页。§5-3

Transcriptionofeukaryoticorganism真核生物基因的转录

共有3类，分别由不同的RNA聚合酶复制。

1.RNApolymerase

RNApolymeraseI:rRNA(28S,18S,5.8S)RNApolymeraseII:mRNARNApolymeraseIII:tRNAand5SrRNAandothersmallRNAs(snRNA).第27页，共54页。Amajordistinctionbetweentheeukaryoticenzymesisdrawnfromtheirresponsetoα-amanitin（α-鹅膏蕈碱）.

AmanitinisabicyclicoctapeptidederivedfromthepoisonousmushroomAmanitaphalloides;itinhibitstranscriptionbycertaineukaryoticRNApolymerases.鹅膏蕈碱是一种来自毒蘑菇的双环八聚体蛋白，它能抑制RNA聚合酶的活性。第28页，共54页。2.PromotersandTranscriptionalfactorsPromoter:

真核启动子可定义为位于转录起始位点附近启动转录所必需的序列。Transcriptionalfactors转录因子：识别并结合在启动子序列上的蛋白因子。PromoterelementsaredefinedbymutationsandfootprintingMutationsinthesitepreventfunctioninvitroorinvivo.

Proteinsthatactbybindingtoasitemaybefootprintedonit.第29页，共54页。第二类RNA聚合酶的启动子：PromoterofRNApolymeraseII:由两部分组成：startpointandupstreamelements上游元件.startpoint:倾向起始于A，其侧翼序列为嘧啶碱基。一般形式为Py2CAPy5.

Atthestartpoint,thereisnoextensivehomologyofsequence,butthereisatendencyforthefirstbaseofmRNAtobeA,flankedoneithersidebypyrimidines.Theinitiator(Inr)thegeneralformPy2CAPy5.TheInriscontainedbetweenpositions-3and+5.第30页，共54页。Upstreamelements:TATAbox:asacrucialpositioningcomponentofthecorepromotercontainsthesequenceTATAA/TAA/T.CAATbox:containsthesequenceGGC/TCAATCTplaysastrongroleindeterminingtheefficiencyofthepromoter.Itfunctionsineitherorientation.GCbox:containsthesequenceGGGCGG.Oftenmultiplecopiesarepresentinthepromoter,andtheyoccurineitherorientation.第31页，共54页。Saturationmutagenesisoftheupstreamregionoftheb-globinpromoteridentifiesthreeshortregions(centeredat-30,-75,and-90)thatareneededtoinitiatetranscription.ThesecorrespondtotheTATA,CAAT,GCbox.第32页，共54页。PromoterscontaindifferentcombinationsofTATAboxes,CAATboxes,GCboxes,andotherelements.第33页，共54页。第34页，共54页。转录因子（Transcriptionalfactors）:真核细胞基因的转录需要大量的转录因子的参与。共有三类转录因子。ThenumberoffactorsthatcanactinconjunctionwithRNApolymeraseIIislarge.Wemaydividethemintothreegeneralgroups.

通用转录因子generalfactors上游转录因子upstreamfactors可诱导的转录因子induciblefactors第35页，共54页。除了启动子序列外，DNA分子中还有一种序列也与转录起始有关。这种序列能够提高转录频率，但它可能远离转录起始位点，在转录位点的上游或下游，这种序列叫增强子（enhancer）。增强子与启动子一样，也是由不同的组件构成的。增强子可以在RNA聚合酶Ⅱ转录的基因中出现，也可以在RNA聚合酶Ⅰ转录的基因中出现。Enhancerelementisacis-actingsequencethatincreasestheutilizationof(some)eukaryoticpromoters,andcanfunctionineitherorientationandinanylocation(upstreamordownstream)relativetothepromoter.

增强子Enhancer:第36页，共54页。

AtypicalgenetranscribedbyRNApolymeraseIIhasapromoterthatextendsupstreamfromthesitewheretranscriptionisinitiated.Thepromotercontainsseveralshort(<10bp)sequenceelementsthatbindtranscriptionfactors,dispersedover>200bp.Anenhancercontainingamorecloselypackedarrayofelementsthatalsobindtranscriptionfactorsmaybelocatedseveralkbdistant.第37页，共54页。§14-4转录后加工—加帽、加polyA尾和剪接Post-transcriptionalevents—Capping,PolyadenylationandSplicing1.Capping：Cap0:m7GpppX:单细胞真核生物，如酵母。Cap1:m7GpppXm：除单细胞真核生物外的其他真核生物。Cap2:m7GpppXmpYm：某些真核生物。第38页，共54页。Capstructure：Thecapblocksthe5’endofmRNAandmaybemethylatedatseveralpositions.第39页，共54页。加帽的功能FunctionofCap:ProtectionofthemRNAfromdegradation.防止mRNA被降解。EnhancementofthemRNA’stranslatability.增强mRNA的翻译能力。TransportofthemRNAoutofthenucleus.有利于mRNA从核内向细胞质转运。Propersplicingofthepre-mRNA.有利于mRNA前体的正确剪接。第40页，共54页。2.Polyadenylation聚腺苷酸化MosteukaryoticmRNAsandtheirprecursorshaveachainofAMPresiduesabout250nucleotideslongattheir3’-ends.Thispoly(A)isaddedpost-transcriptionallybypoly(A)polymerase聚腺苷酸化酶.Polyadenylationsignals加尾信号:AAUAAA.Functions:Poly(A)enhancesboththelifetimeandtranslatabilityofmRNA.提高了mRNA的寿命和翻译能力。第41页，共54页。第42页，共54页。Poly(A)+RNAcanbeseparatedfromotherRNAsbyfractionationonSepharose-oligo(dT).第43页，共54页。3.Splicing剪接Productsoftranscription:1)rRNAsplicing2)tRNAsplicing3)Nuclearpre-mRNA第44页，共54页。含有内含子的转录物中剪接区的碱基序列基因区域外显子内含子外显子卵清蛋白内含子2UAAGGUGAGC---------UUACAGGUUG卵清蛋白内含子3UCAGGUACAG---------AUUCAGUCUGβ‐珠蛋白内含子1GCAGGUUGGU---------CCUUAGGCUGβ‐珠蛋白内含子2CAGGGUGAGU―――CCACAGUCUC免疫蛋白λ内含子1UCAGGUCAGC―――UUGACGGGGCSV40病毒早期T-抗原UAAGGUAAAU―――UUUUAGAUUC1)真核生物基因内含子的结构特点第45页，共54页。真核生物基因内含子的结构特点：1.内含子的大小:50～10000nt；2.5’-末端绝大多数为GU开始；3’-末端绝大多数为AG结束；3.在3’-末端的上游20～50nt处，有一段称为分支点（branchsite）的序列，在酵母中，此序列几乎都是UACUAAC，哺乳动物中有多种不同的序列；4.在5’-末端、3’-末端及分支点保持不变的情况下，可在内含子中插入不同大小的外源基因片段，而且不影响基因的加工。第46页，共54页。Theonlythreesequencesneededforsplicingare:shortconsensussequencesatthe5’and3’splicingsitesandatthebranchsite分支位点.TheendsofnuclearintronsaredefinedbytheGT-AGrule.Splicingsignals剪接信号：第47页，共54页。Thesplicingeventrequiresbreakage