DB42∕T 2252-2024 《牛无绿藻PCR-RFLP检测技术》

DB42湖北省市场监督管理局发布I 2 2 2 3 4 5 6 6 8本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。对本文件的有关修改意见建议请反馈至武汉市农业科学院，联系电话邮箱：1牛无绿藻PCR-RFLP检测技术本文件适用于生鲜乳中牛无绿藻的定性检测、实验GB4789.2食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数GB/T6682分析实验室用水规格和NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范SN/T3902检验检疫二级生物安全4缩略语DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyriboNucleicAciPIM：无绿藻分离培养基（ProtothecaIsolationMedTSB：胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TryptoneSoybeanBrothMePCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReactPCR-RFLP：限制性片段长度多态性聚合酶链反应（RestrictionFragmentLengtPBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSalTAE：三乙醇胺四乙酸缓冲液（Tris-acatate-ethyleneDiamineTetraaceticAcidBu2物，可扩增牛无绿藻，然后通过特异性的限制性酶切反应，鉴定牛a)超净工作台；3表2配制表3氯化钠5磷酸氢二钾7.1.5阳性对照：含有牛无绿藻cytb基因序列的重组pMD18-T载体(20ng/mL)。7.1.6阴性对照：无菌双蒸水(符合GB/T6682中的二级水质要求)。a)离心管(1.5mL,200μL);c)移液器吸头(1mL,200μL,10μL)。4789.2进行样品的稀释。然后，将100μL样品均匀地涂布在PIM平板上，并在37℃下培养48h～72挑取纯化的牛无绿藻单菌落样品接种在10mLTSB培养基中，置于37℃,180rpm,恒温震荡培养箱收集的样品放置于冰上或者2℃~8℃条件下保存，尽快进行检测。制备的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h;若需长期保存，应置于-80℃冰箱保存。4吸取上清，冰上或者2℃~8℃条件下保存，尽快进行检测。制备的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h;若需长期保存，应置于-80℃冰箱保存，避免反复冻融。PCR扩增反应体系配制见表3。表3中引物2下游引物25总体积进行PCR反应。反应程序为：95℃预变性5min;95℃变性30s,54℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环；72℃终延伸5min;4℃保存。PCR-RFLP酶切反应体系配制见表4。将表4的反应体系(不含PCR产物)充分混匀后，每个反应管中37℃下酶切10min(RsaI,10U/μL),然后在65℃下酶切10min(TaiI,10U/μL)。体系(HL)限制性内切酶缓冲液5总体积59.5电泳PCR产物电泳：配制1%琼脂糖凝胶，将1g琼脂糖放入100mL1×TAE电泳缓冲液中，加热后充分溶解，待温度降至50℃左右时，加入5μL的GelRed荧光染色剂或者按照商品说明加入其他同等效应的染料，混合后铺板。5μLPCR反应产物，包括被检样品、阳性对照、阴性对照；5μL的DL2000DNAMaker,点样进行琼脂糖凝胶电泳。酶切产物电泳：配制4%琼脂糖凝胶，将4g琼脂糖放入100mL1×TAE电泳缓冲液中，加热后充分溶解，待温度降至50℃左右时，加入5μL的GelRed荧光染色剂，混合后制胶。取20μL酶切反应产物，包括被检样品、阳性对照和阴性对照；5μL的DL500DNAMaker,点样进行琼脂糖凝胶电泳。9.6凝胶成像电泳结束后，用凝胶成像仪观察检测DNA成像结果，拍照，记录结果。10结果判定10.1质控标准PCR结果：牛无绿藻阳性对照样品，PCR扩增产物经电泳后，出现大小为644bp的特异性扩增条带，阴性对照无任何扩增条带，符合图1。图1牛无绿藻PCR鉴定图6酶切结果：牛无绿藻阳性对照样品，酶切产物经电泳后，出现大小分别为47bp、161bp、411bp的三条带，阴性对照无条带，符合图2。质控结果应与上述描述一致。10.2结果判定样品PCR扩增未出现特定性的阳性扩增条带或酶切结果未出现与阳性对照大小一致的三条带，判定为阴性；样品PCR扩增出现大小为644bp特异性阳性扩增条带，且酶切结果出现与阳性对照大小一致的三条带，判定为阳性。11实验室生物安全要求实验室应符合SN/T3902要求，实验室生物安全应符合GB19489要求。12标准实施及评价12.1本标准公开征求意见期间，收集到行业内15家单位的15位专家的回执意见，对标准草案提出94条修改意见现已根据修改意见全部进行了修改或说明，两家权威单位对本标准的方法验证进行了验证，为本方案的实施做好了切实的准备。12.2本标准的实施，适用于生鲜乳中牛无绿藻的定性检测、实验室诊断，为保证试验结果的严谨性和准确性，样品的采集应符合NY/T541乳汁样品采集技术要求，实验室环境和配套设施应符合SN/T3902要求。12.3针对标准中相关的样品采样人员和实验室人员需进行标准的宣贯和培训，详细解说标准各章条内容，确保严格按照标准要求操作。12.4牛无绿藻在全球及我国多省广泛流行，本标准的实施，可以对生鲜乳中牛无绿藻进行鉴定，有利于牛无绿藻的防控，保障公共卫生安全。12.5依据《中华人民共和国标准化法》,为对本标准实施进行检查，相关实施人员可将本标准实施应用中的疑问进行逐条记录，并联系牵头起草单位武汉市农业科学院，联系电话邮箱：78(资料性)湖北省地方标准实施信息及意见反馈表湖北省地方标准实施信息及意见反馈表如表A.1所示。表A.1湖北省地方标准实施信息及意见反馈表标准名称及编号牛无绿藻PCR-RFLP检测技术总体评价该标准与当前所在地的产业或社会发展水平是否该标准的特色要求与其他强制性标准的主要技术指标、相关法律法规、部门规章或