【《荧光光谱法的理论基础概述》3200字】

荧光光谱法的理论基础概述目录TOC\o"1-3"\h\u22477荧光光谱法的理论基础概述 1110391.1荧光产生原理 1149941.2荧光光谱法 220961.3荧光的发光方法 289291.3.1直接发光法 386721.4荧光光谱分类及同步荧光光谱法 3272981.5荧光光谱基本参数 4261891.5.1激发光谱 4153401.5.2发射光谱 5168601.6外部环境影响因素 51.1荧光产生原理荧光是指一种光致发光的冷发光现象，其本质是光线。当使用紫外波段至红外波段的光对物质进行照射，物质会产一些光线，当停止照射时，光线就消失不见，这种光线我们称为荧光。在进行抗生素的检测中常常使用荧光技术，此类技术是非常不错的手段，有突出的优点和特点，图1.1为荧光的产生过程。其原理是大部分的物质，在不受外界干扰下分子是处于单重态的，此时当光线对分子进行照射，那么处于单重态的分子通过吸收能量而转变为激发单重态。处在激发单重态的分子在结构上容易发生变化，因此转变为激发单重态后，分子将会通过内部转换的辐射跃迁或衰变而返回基态，在从激发单重态跳到基态的时就会伴随荧光的出现[19]。在此时对荧光信号进行捕捉，进行针对性的分析，这就是荧光光谱法。图1.1荧光的产生1.2荧光光谱法荧光光谱的原理是，光波在振动周期内传播的距离存在差异，荧光光谱就是这个不同距离的相对强度，当光波的长度和强度处于不同状态时，就可以绘制出形状不同的光谱。当波在一个振动周期内传播的距离以及强弱程度保持不变的情况下，能够通过光源发出的光分离成所需要的单色光的器件来检测不同的荧光强弱程度，绘制的曲线就称为荧光光谱。荧光光谱法其特点众多，优点更是突出：灵敏度高——荧光光谱法由于其技术本身的特点，在测试过程中具有很强的针对性，也就是＂灵敏度＂高。这是由于其在入射光的90度方向进行发射光谱扫描，送就形成了一个暗背景操作，所以相比于紫外分光光度法等技术就相对的提高了所要光的强度。选择性强——传统的荧光光谱法、同步荧光光谱法和其它通用荧光光谱法等只能得到荧光光谱和激发光谱。荧光光谱可以同时扫描波长和发射波长，并且可以获得更多的样品差异信息，利用差分特征可以方便、准确地进行鉴别。（3）样品用量少——在一些其他测试方法中往往用大量的实验样品进行实验，但荧光光谱法针对性强且灵敏度高，所以避免了此类缺点，只需少量样品即可得到同样的效果。这种好处是更容易对于稀缺样品或者数量不多的的情况进行检测。（4）信息量丰富——因为荧光光谱法其自身包含多种物理参量，这些物理参量能准确的代表分子的关键信息，所以荧光法可提供多种多样的样品信息。（5）方便，快速——在一些常规检测方法中，常会对复杂的成分进行分离、萃取、提纯等复杂的预处理，利用荧光光谱检测只需要稀释、澄清等操作便可。再有其扫描速度比其他方法快很多，大大缩短了检测时间。此外，实验仪器内部运转原理及程序设置往往复杂难懂，但实验仪器操作简单，上手容易，可根据使用说明书便可完成实验操作。（6）环保——由于其样品用量少且没有需要加入有机溶剂等才能进行的复杂前处理，所以不会带来环境污染[20]。1.3荧光的发光方法抗生素检测中的荧光发光方法主要根据物质本身产生荧光能力的大小或者荧光量子产率能力的高低来决定，一般情况下有直接发光法和间接发光法两种。1.3.1直接发光法抗生素的直接发光法需要抗生素本身能发出大量光线，并且荧光量子能被仪器检测到。喹诺酮类抗生素能直接产生较强的荧光，因为此类分子中具有大的共轭π键结构，这类抗生素一般可用来直接发光法测定。所以此类方法对抗生素发射荧光的能力有一定的要求。1.3.2间接发光法若抗生素达不到直接发光法的情况下，这类抗生素就需要采用间接发光法进行检测。在抗生素检测中，间接发光法主要有三类，分别是荧光衍生法、荧光猝灭法、敏化荧光法等[21]。1.4荧光光谱分类及同步荧光光谱法目前，荧光光谱技术主要有六类：（1）常规荧光光谱技术常规荧光分析法只要被测物质自身可以产生荧光，即可通过测量荧光强度来反演出被测物质的浓度。可以产生荧光的物质均有特殊的能级与其相对应，即拥有属于该物质的激发光谱与发射光谱。不同物质可以根据这一特性进行准确的定性。（2）三维荧光光谱技术近几年科技不断发展，荧光技术不断完善，一些研究人员发明了一种三维的新型荧光分析方法。三维光谱一般由三个轴组成一个立体的图像，与二维光谱图的技术特点相似，不同的变量是增加了波长变化时荧光强度的变化情况。（3）同步荧光光谱技术同步荧光光谱有很多分类，同步荧光分析法的技术特点是对激发波长和发射波长同时进行扫描并绘制成光谱]。与常规荧光光谱法相比，某些光谱法可能由激发光谱决定，某些用发射光谱决定，但同步法师二者共同决定。激发波长和发射波长间保持恒定的波长间隔Δλ（Δλ＝Δλeｍ－Δλex）,并同时对被测物质的吸收特性和发射特性加以利用，进一步改善了荧光光谱的选择性[22]。（4）导数荧光光谱技术导数荧光光谱二维图的横坐标是以荧光强度对荧光波长求导所得，横坐标是荧光波长。可求一阶、二阶等不等阶数的荧光光谱[23]。（5）时间分辨荧光光谱技术理论上，根据“荧光寿命”特定波长在不同时间段的荧光强度为纵轴，波长为水平轴，获得二维图形是时间分辨荧光光谱。当激发波长执行相同的操作，可以得到激发波长时间分辨荧光光谱。（6）空间分辨荧光光谱技术空间分辨荧光光谱实现原理更为复杂，研究方向也更加深入。主要是对三维立体空间的某一特定点进行取样确定，读取出光谱信息。本实验采用恒波长同步荧光光谱技术。为了不影响信号形状和强度，前期需要测得合适的发射波长和激发波长。为了得出理想的同步荧光光谱，需要在荧光材料上进行大量的初步实验。初步试验是为了对不同差值的进行比较，当接近于斯托克斯位移的波长差时，半峰宽度最小，对后续实验影响最小，同步荧光信号最强，效果最好，当存在杂质会导致出现瑞利散射和拉曼散射，这将导致实验结果出现巨大误差，但选择合适的差值会减小干扰和误差。综上对于成分复杂的荧光物质，利用同步荧光光谱高灵敏度和选择性强的特点进行操作，会带来极大的便利。每种抗生素的分子结构存在大大小小的差异，这种分子结构不确定的因素就导致其吸收光和发射光的波长存在不同。利用同步荧光光谱法是针对他的特点测出物质间的不同。同一物质浓度的高低导致结果也不相同，由于分子密度增加所发射出的荧光强度也就越强；当密度不够大，所得到的结果十分微小，分析起来非常困难。1.5荧光光谱基本参数1.5.1激发光谱当单位面积上所接受可见光的光通量在一个合适的状态，物质中的带负电的亚原子粒子处于电子被激发到较高能级但尚未电离的状态，回落到电子在离核最近的轨道上，产生一定波长的物质。荧光物质处在红外光线到紫外光线的状态时，能被测出的荧光强度就是激发光谱。激发光谱的波长也就是处于某一波长的相对激发效率。1.5.2发射光谱发射光谱是指光源所发出的光谱，发射光谱的内部原理是波在一个振动周期内传播的距离为某一定值时，发射荧光的光的强度在一定区域内的变化情况，也就是不同波长所有频谱的电磁辐射的相对强度。而要绘制发射光谱，则就需要以λex为激发光源,然后对其所发射的光谱进行相应的扫描，在此基础上完成各波长的荧光强度的检测。待检测完成后进行数据的记录，再以荧光强度F对发射波长λ作图，最后得到的就是发射光谱。1.6外部环境影响因素（1）散射光的影响一般拉曼散射和瑞利散射为主要影响因素，当物质产生的荧光强度较弱或者样品未经预处理后导致颗粒较大时的情况。（2）温度的影响温度会影响样品分子的内部运动，同时光路中存在水蒸气，水蒸气的含量也会受温度的影响，当水蒸气含量过大时光源无法对物质进行百分百的照射，就导致能量分配不均。所以实验过程中要保持温度一致。（3）光源的影响当光源强度发生变化时，对光谱