骨修复材料体外成骨性能评价方法

1本标准规定了一种基于细胞薄膜技术的三维体外评价模型试验方法。本标准适用于骨修复材料的细胞毒性和成骨性能评价。2.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T16886.5医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品YY/T0127.9-2009口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法细胞毒性试验:琼脂扩散法及滤膜扩散法YY/T0511-2009多孔生物陶瓷体内降解和成骨性能评价试验方法YY/T1616-2018组织工程医疗器械产品生物材料支架的性能和测试指南YY/T1477.5-2020接触性创面敷料性能评价用标准试验模型第5部分：评价止血性能的体外模型YY/T1680-2020脱矿骨材料的成骨诱导功能评价YY/T1575-2017组织工程医疗器械产品修复和替代骨组织植入物骨形成活性的体内评价指南3.术语和定义下列术语和定义适用于本文件。骨修复材料BoneReplacementMaterial骨修复材料是一类由人工合成、具有多种优良理化特性（能自固化成型、机械强度高、使用方便等）和生物学特性（无毒副作用、可以吸收和降解、生物相容性好、能诱导骨细胞和血管生长等）的骨修复材料。3.2成骨osteogenic成骨细胞移行至将要合成骨组织的部位,分泌、合成骨胶原及骨蛋白纤维,将钙、磷吸收到纤维的孔隙中进行沉淀结晶,形成骨组织的过程。本试验利用三维体外骨组织模型评价骨修复材料的细胞毒性与成骨性能。适用于大部分骨修复材料，包括颗粒和支架。25.试验方法5.1三维体外骨组织模型制备5.1.1细胞系选用小鼠成骨前体细胞系[如来源自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1]，具有成骨诱导后形成成骨细胞的能力。5.1.2培养基完全培养基：含有10v/v%胎牛血清（FBS）的DMEM（Dulbecco'smodifiedeaglemedium）培养基，内含10v/v%青链霉素，用于细胞生长。成膜培养基：具体成分如下表格，用于细胞成膜培养。5.1.3制备方法成薄膜培养基组分含量DMEM500mL地塞米松抗坏血酸0.05g/LFicoll40025g/LITS细胞培养添加物1w/v%青链霉素10v/v%FBS1w/v%5.1.3.1细胞薄膜培养辅助环制备利用双组份食品级硅胶制备细胞薄膜培养辅助环。将硅胶双组份按1:1混合均匀，使用真空泵除去硅胶中的气泡后，将硅胶浇筑于内径为15.5mm，外径为28mm，高度为8mm的环形模具中，应使硅胶填充至与环形模具边缘平齐，在记录中注明模具的材质。再次使用真空泵除去硅胶中的气泡，70℃的烘箱中交联24h，脱模具，获得细胞薄膜培养辅助环。辅助环一面平整光滑以保证可以紧贴培养皿。注1：合适的惰性模具材料可以是聚甲基丙烯5.1.3.2体外三维模型制备裁剪直径5mm的圆形封口膜，将其贴于35mm细胞培养皿的正中间，再将细胞薄膜培养辅助环放在培养皿上，保证封口膜在其环形中央位置。用成膜培养基配制成4×105-8×105细胞/mL细胞悬液，每个辅助环内加入0.5mL细胞悬液，培养4-8天，每2天换液一次，促进细胞成膜。取下辅助环，然后沿侧壁使用1mL移液枪轻轻吹打细胞薄膜边缘，使其剥离，获得中间带孔（直径5mm的圆形孔）的细胞薄膜；将剥离的细胞薄膜用5ml移液管转移到35mm细胞培养皿中，吸干周围的培养基，于37℃、5%的CO2培养箱内放置30min，使细胞薄膜粘接到培养皿上。将第二片剥离的细胞薄膜通过移液管转移到第一片之上，铺展并重叠，吸干周围的培养基，于37℃、5%的CO2培养箱内放置30min，使两片细胞薄膜充分粘接。重复以上操作，堆叠三层中间带孔的细胞薄膜，获得中间带有圆形孔缺损的三层细胞薄膜仿生骨组织，构建三维体外骨组织模型。3注2：常用的实验室封口膜即可，提前通过紫外线或酒精对封5.2测试方法5.2.1样品准备样品应无菌。a)支架：制成直径约5mm的圆形试样，厚度2mm。b)颗粒：将材料填入内径5mm，高2mm的环形模具中。在记录中注明模具的材质。应在填入材料之前将环形模具置于三维体外骨组织模型的中间缺损处，成型后移除。5.2.2空白组三维体外骨组织模型和培养基5.2.3阳性对照组三维体外骨组织模型、培养基和阳性对照材料如羟基磷灰石5.2.4阴性对照组三维体外骨组织模型、培养基和阴性对照材料如纯镁5.2.5试验组三维体外骨组织模型、培养基和试验材料5.2.6材料在二维细胞模型和三维体外骨组织模型中细胞毒性测试5.2.6.1材料在三维体外骨组织模型中细胞毒性测试将试验骨修复材料置于三维体外骨组织模型的中间缺损处。为防止材料在加入培养基后离散，其上覆盖商用胶原膜，加入1-2mL培养基培养。在12h、24h、48h三个时间点，使用移液器向每样中加入100μLCCK-8溶液，孵育3.5小时。每样取120μL加入到96孔板中，至少3个复孔。使用酶标仪测量450nm处的吸光度。5.2.6.2材料在二维细胞模型中细胞毒性测试参照ISO10993-5:2009，用完全培养基配制成4×104细胞/mL细胞悬液，接种在96孔板中，每孔内加入100μL细胞悬液，培养1天使细胞贴壁。用完全培养基配置1mg/mL材料溶液，每孔加入10μL，相当于0.01mg材料/孔，并保证初始接种103个细胞对应0.0025mg材料。设置空白组、阳性对照组、阴性对照组，和试验组，至少3个复孔。在12h、24h、48h三个时间点，使用移液器向板的每个孔中加入10μLCCK-8溶液。将培养板在培养箱中孵育3.5小时。5.2.7材料成骨活性测试5.2.7.1成骨诱导将试验骨修复材料置于三维体外骨组织模型的中间缺损处。为防止材料在加入培养基后离散，其上覆盖商用胶原膜，加入1-2mL成骨诱导培养基，培养28天，每2天换液1次。5.2.7.2茜素红染色4在培养第28天，进行茜素红S染色以及定量。将贴壁混合细胞使用磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗3次，加入固定液覆盖细胞固定30min。吸去固定液，PBS清洗3次，滴加茜素红S染液，覆盖样品，于室温下染色30min。吸去茜素红S染液，蒸馏水清洗3次，晾干，显微镜下观察成骨细胞矿化结节中的钙质染色。进一步对钙质进行定量，每个培养皿中加入1mL的10%溴代十六烷基吡啶（CPC）摇床上轻摇1h以结合茜素红，洗脱好的CPC移入EP管中，用10%CPC稀释20倍，用于测定。酶标仪测定波长562nm吸光度。5.2.7.3Westernblot法检测成骨相关蛋白在培养第14天和28天提取组织总蛋白，通过westernblot法检测成骨相关蛋白。包括启动成骨分化的Runt相关转录因子2（Runt-relatedtranscriptionfactor2,Runx2）、调控骨矿化的成骨细胞特异性转录因子Osterix（OSX）、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）、骨钙素（osteocalcin,OC）。配制10%分离胶，配制5%浓缩胶。随后用SDS对各组蛋白质进行分离，根据蛋白浓度计算上样量，一般为20μg，可适量加至40μg。在电泳槽中加入已经配置混合均匀的RunningBuffer，在1-2个泳道中加入3μLMarker，其余每个泳道加入已制备好的蛋白样品。首先86V跑出浓缩胶，然后200V电泳至分离出目的条带。转膜完成后，使用5%脱脂奶粉室温封闭1h。将相应的抗体置于PVDF膜上，室温孵育1-2h或者4℃冰箱过夜。加入牛奶稀释的二抗室温孵育1-2h。完成后可于显影仪显影。6.结果评价6.1材料细胞毒性评价按式（1）计算细胞存活率：细胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%………………（1）式中：As:实验组吸光度；Ac:对照组吸光度；Ab:空白组吸光度。6.2材料成骨活性评价6.2.1矿化结节按式（2）计算矿化结节：矿化结节评价=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%………………（2）式中：As:实验组吸光度；Ac:对照组吸光度；Ab:空白孔吸光度。6.2.2成骨相关蛋白表达按式（3）计算成骨相关蛋白表达：5蛋白相对表达量=I目的蛋白/I内参蛋白………………（3）式中：I目的蛋白：目的蛋白灰度值（如Runx2、OSX、O