TCSES80-2023淡水生物DNA条形码构建技术规程

T/CSES80—TechnicalregulationsforconstructionofDNAbarcodesoffreshwater 发T/CSEST/CSES80— 前 引 DNA条形码构建方 DNA条形码构建流 附录A（资料性）常用DNA条形码引物及PCR扩增条 附录B（规范性）遗传距离分析原理和方 附录C（资料性）DNA条形码数据表 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 T/CSEST/CSES80—GB 实验室GB/T GB/T GB/T GB/T HJ 生物多样性观测技术导则HJ HJ 生物多样性观测技术导则水生维管植物HJ 水质浮游植物的测定0.1ml计数框-LY/T SC/T SN/T SN/T SN/T DB21/T DB32/T 引物[来源：GB/T30989—聚合酶链式反应polymerasechainSangersanger[来源：GB/T34265—2017，3.2]高通量测序high-throughputDNADNA遗传距离genetic16SDNA16SribosomalDNA；16S18SDNA18SribosomalDNA；18S12SDNAmitochondrial12SribosomalDNA；Mt12ScImitochondrialcytochromecoxidase凭证标本voucherFASTAFASTA[来源：SN/T4278—B阴性对照negative阳性对照positive DNA提取试剂。 通用PCR PCR PCR 通用DNA浓度测定试剂盒：主要成分包括缓冲液和染色剂。 竖式采水器：2L5L 13000rpm41µL230nm、260nm280nmPCR121℃、18min 低温冰箱：4℃，-20℃和-80采样瓶：100mL1000mL微量移液器：0.5～10µL、20～200µL100～1000µL离心管：1.5mL、2mL、5mL50mLDNAPCR管、96孔板等PCRDNADNA DNA图1DNA 水生维管束植物的采集与鉴定按照HJ710.12的规定执行，按照LY/T3191大型底栖无脊椎动物的采集与鉴定按照HJ710.8的规定执行，加乙醇溶液固定（鱼类的采集与鉴定按照HJ710.7的规定执行，野外干冰或-20℃保存，实验室-20℃保存；或 DNA提取。nm应＞2.0DNA样品分装为两份，一份在-80℃长期保存，另一份保存在-20℃用于后续实DNA条形码序列，常用PCR扩增引物和扩增反应条件见附录A。1%～2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR的条带。若出现多个条带，需重新扩增或纯化PCRSN/T4278的规定执行。对目标条带进行Sanger测序，应满足GB/T34265的规定。为降低Sanger测序出现双峰或者测序失败SN/T4278的规定先将PCRSanger测 将Sanger测序的双端测序文件进行拼接，按照GB/T34265的规定去除测序结果两端的低质量序列。阴性对照PCR阳性对照的PCRDNA DNA提取及后续实验过程中的污染。PCRDNAPCRPCRDNA，同步进行PCR扩增。 为防止外源污染，实验前，应将实验耗材（PCR管等）进行高压蒸汽灭菌，用漂白剂（1.5%）擦拭桌面。30min废弃物的分类、收集、存放和集中处理应按照GB19489和SN/T4835的规定执行，其中生物废弃物附录表 引物序列（5'-16S18SMt16S-12S2对引物结表 引物序列（5'-18S_V4-18S_V4-COI-COI-Mt12SrDNA-Mt12SrDNA-Mt12SrDNA-Mt12SrDNA-Mt16S附录

图 FASTA格P——nd——n——

𝑝=

−3logdj——p——

3

𝑑=-loge(1-2P-Q)-loge(1- dk——ns——存在转换的核苷酸数目；nv——存在颠换的核苷酸数目；n——总的核苷酸数目。

MEGA11FASTA图 序列导入MEGA11窗口截byClustalW（Codons）或AlignmentbyMUSCLE（Codons）），进行多序列比对。结果见图B.3。检查蛋白编码基因是否存在终止密码子，并手动修剪两端序列，保持序列对齐。点击Data，选择Export图 序列比对后MEGA11窗口截2-parametermodel，计算基于K2P模型的遗传距离。基于Rseq<-msaseq.alin<msa(seq,methodClustalW")#ClustalW方法比对序列seq.alin<-msa(seq,method="Muscle")#Muscle方法比对序列ape包将比对结果转化成DNAbinseq.dnabin<-dist.seq<-dist.dna(seq.dnabin.trim,model=dist.output<-as.matrix(dist.seq)write.csv