（正式版）DB42∕T 1630-2021 《玉米赤霉烯酮降解酶活力的测定》

DB42Determinationofenzymeactivityofzearalenone-degrad湖北省市场监督管理局发布I 2 2 2 2 2 3 4 5 6本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件起草单位：湖北大学、中国农业科学院油料作物玉米赤霉烯酮降解酶活力的测定尚没有相关国家和行业标准，本文件的实施解决了玉米赤霉烯酮素脱毒技术的发展，对推动玉米赤霉烯酮降解酶本文件通过紫外检测器和荧光检测器两种方法来检测玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力，两种方法的都具备，更具有普遍性，更容易被广大企事业单位接11范围本文件规定了玉米赤霉烯酮降解酶(zearalenone-degradingenzyme,英文缩写：ZHD)的活力检测方法。本文件适用于玉米赤霉烯酮降解酶产品，最低检出量为0.2U/g(U/mL)。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。玉米赤霉烯酮降解酶活力单位/ZHD活力单位(U)ZHDactivityunit在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为10μg/mL的玉米赤霉烯酮溶液中降解1μg玉米赤霉烯酮所需的酶量为一个玉米赤霉烯酮降解酶活力单位(U)。4原理ZHD能降解底物玉米赤霉烯酮(zearalenone,英文缩写：ZEN),ZEN的降解量与ZHD的活性成正比。通过高效液相色谱检测反应前和反应后残留的ZEN含量，可以计算得出玉米赤霉烯酮降解酶ZHD活力单5试剂和材料5.1通用要求：除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682中二级水的规定。5.2甲醇(CH₃OH):色谱纯。5.3乙腈(CH₃CN):色谱纯。5.4乙腈/水(60/40,v/v):取60mL乙腈加40mL水。5.5乙腈/水/甲醇(46/46/8,v/v/v):取46mL乙腈，加46mL水和8mL甲醇。5.6微孔滤器：孔径0.22μm,有机相。5.7玉米赤霉烯酮ZEN标准品：纯度≥99.0%。5.8玉米赤霉烯酮ZEN标准溶液：准确称取1mg的ZEN标准品，用1mL色谱级甲醇配成浓度为1mg/mL的标准储备液，充分混匀，现配现用。25.9磷酸氢二钠溶液(0.2mol/L):称取磷酸氢二钠14.20g,加水溶解，定容至500mL。5.10柠檬酸溶液(0.2mol/L):称取柠檬酸19.21g,加水溶解，定容至500mL。5.11磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(0.2mol/L,pH5.5):取50mL0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，用大约18mL0.2mol/L柠檬酸溶液进行调节，用pH计测定使缓冲液pH为5.5。6.2离心机：离心转速不低于12000r/min。6.4天平：感量0.1mg。6.5恒温水浴锅：37℃。6.7秒表：每小时误差不超过5s。6.8分样筛：孔径为0.25mm。固态试样应粉碎或充分碾碎，过0.25mm孔径筛。称取适量试样两份，精确至0.1mg,分别置于mL锥形瓶中，加入100mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(见5.11)。摇床或磁力搅拌提取30min,离心机4000r/min离心5min,取上清液再用磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲溶液(见5.11)做二次稀释，使稀释后的移取适量样品，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(见5.11)进行稀释、定容，稀释后的待测酶液中或柠檬酸溶液(见5.10)调整校正至pH5.5,再用磷酸氢二钠-柠檬酸溶液(见5.11)适当稀释并定容。流动相：乙腈/水(60/40,v/v);流速：1.0mL/min;柱温：30℃;3在1.5mL的一次性小管中加入480μL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(见5.11),再加入10μL的底物ZEN(1mg/mL,用色谱纯甲醇配制),体系中有10μgZEN,在37℃孵育10min。移取1mL待测酶液，置于具塞试管内，在37℃孵育5min。实验组：取10μL经过37℃孵育的待测酶液，加入小管(见)中，混匀；对照组：取10μL经过37℃孵育的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(见5.11),加入小管(见)中，混匀。在37℃反应10min后，加入500μL色谱纯甲醇终止反应，最后得到1mL的体系。体系中残留的ZEN应按照7.3.1中规定的检测条件进行检测，上样量20μL,高效液相色谱测得峰见附录A,峰面积实验组为S,对照组为So,做三次平行。通过线性回归方程计算ZHD活力单位。流动相：乙腈/水/甲醇(46/46/8,v/v/v);检测波长：激发波长274nm,发射波长440nm;柱温：30℃;进样量：20μL。4图2ZEN标准品的高效液相色谱荧光检测法色谱图7.4.2标准曲线的绘制取6支1.5mL的塑料小管，用色谱纯甲醇将ZEN标准溶液逐级稀释得到浓度为0.2μg/mL、0.5μg/mL、绘制标准曲线，获得线性回归方程，R²达到0.99。在1.5mL的一次性小管中加入480μL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(见5.11),再加入10μL的底物ZEN(1mg/mL,用色谱纯甲醇配制),体系中有10μgZEN,在37℃孵育10min。移取1mL待测酶液，置于具塞试管内，在37℃孵育5min。实验组：取10μL经过37℃孵育的待测酶液，加入小管(见)中，混匀；对照组：取10μL经过37℃孵育的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(见5.11),加入小管(见)中，混匀。在37℃反应10min后，加入500μL色谱纯甲醇终止反应，最后得到1mL的体系。体系中残留的ZEN应按照7.4.1中规定的检测条件进行检测，上样量20μL,高效液相色谱测得峰面积实验组为S,对照组为So,做三次平行。通过线性回归方程计算ZHD活力单位。8试验数据处理试样中ZHD活力单位以X,表示，单位为酶活力单位每毫升(U/mL),按式(1)计算：……XD——试样稀释液中ZHD活力单位，单位为酶活力单位每毫升(U/mL);k——标准曲线斜率；S——实验组峰面积；1——最后反应体系体积1mL;0.01——反应体系中所用的酶体积(mL