DB15T 3170-2023 籽用西葫芦种子病毒RT-PCR检测技术规程_第1页
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文档简介

152023-09-15发布本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定本文件主要起草人：王萍、刘杰才、陈贵华、许珂、尚鹏、李石恒、I籽用西葫芦种子病毒RT-PCR检测技术规程本文件规定了籽用西葫芦种子病毒RT-P本文件适用于籽用西葫芦种子中黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvi3.1黄瓜花叶病毒cucumbermos3.2西瓜花叶病毒watermelonmosaicvir种类。受侵染的病株叶片表现花叶、畸形、新生3.3小西葫芦黄化花叶病毒zucchiniyellowmosaic可由多种蚜虫以非持久性方式传播，也能通14.2核酸染料。4,6TE缓冲液(pH8.0)：分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(见4.5)和2mL乙二胺四乙酸4,11CMV病毒检测上游引物CMV-F:5´-TTCGATAAGAAGCTTGTTTCGCG-3´,下游引物CMV-R:5´-4.13ZYMV病毒检测上游引物ZYMV-F:5´-ATGCAGAGGCACCATACAT-3´,下游引物ZYMV-R:5´-5.3PCR扩增仪。5.6凝胶成像系统或照相系统。2经过RT-PCR扩增和测序分析精确不含采集适量的籽用西葫芦种子，放入自封袋中8.1.3RNA浓度检测：提取的样品总RNA用Nanodrop微量分光光度计测定RNA相对浓度，当OD260/OD2808.2反转录8.3PCR扩增38.4琼脂糖凝胶电泳检测8.4.2电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上成像，进行结果分析。如需通过序列分析确认PCR扩增片段是否为目的DNA片段，按照8.4.3的规定执行。9.1.2试样和阳性对照扩增出CMV病毒特异性条9.1.3试样、阴性对照和空白对照未扩增出CMV病毒特异性条带，阳性对照扩增出9.1.4阳性对照未扩增出CMV特异性条带，试样、阴性对照和空白对照扩增出CMV特异性条带或条带不清楚。说明检测结果无效，将实验中的所有9.2.1判定条件：RT-PCR产物在485bp处有无条带（参9.2.2试样和阳性对照扩增出WMV病毒特异性条带，阴性对9.2.3试样、阴性对照和空白对照未扩增出WMV病毒特异性条带，阳性对照扩增出WMV特异49.2.4阳性对照未扩增出WMV特异性条带，试样、阴性对照和空白对照扩增出WMV特异性条带或条带不清楚。说明检测结果无效，将实验中的所有9.3ZYMV基因检测结果分析9.3.4阳性对照未扩增出ZYMV特异性条带，阴性对照和空白对照扩增出ZYMV特异性条带或条带不清楚。说明检测结果无效，将实验中的所有试剂更换，并重新提取样品RNA，进行RT-PCR检测。5注1：序列方向为5´-3´。注

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