分子生物学第五六章的损伤修复基因突变重组与转座补充

（优选）分子生物学第五六章的损伤修复基因突变重组与转座补充第一页，共九十五页。5.1DNA的损伤由于染色体DNA在生命过程中占有至高无上的地位，DNA复制的准确性以及DNA日常保养中的损伤修复有着特别重要的意义。第二页，共九十五页。5.1DNA的损伤由于染色体DNA在生命过程中占有至高无上的地位，DNA复制的准确性以及DNA日常保养中的损伤修复有着特别重要的意义。第三页，共九十五页。DNA损伤是指在生物体生命过程中DNA双螺旋结构发生的任何改变。主要分为两种：单个碱基改变双螺旋结构的异常扭曲（链内T二聚体、单链缺口、凸起等）第四页，共九十五页。引起DNA损伤的因素很多，包括：DNA分子自发性损伤物理因素损伤化学因素损伤第五页，共九十五页。

DNA复制过程中的损伤指碱基配对时产生的误差经过DNA聚合酶等综合校对因素作用后仍未被校正的DNA的损伤。如：大肠杆菌DNA复制无DNA聚合酶校正时错配率为10-1~10-2，识别校正后为10-5~10-6，再经过其他因素，错配率达到10-10这类损伤主要包括5种因素5.1.1DNA分子自发性损伤第六页，共九十五页。指碱基发生烯醇式-酮式结构互变时，氢原子位置的可逆变化，使碱基配对发生改变，这样在复制后的子链上就可能出现错误。

如：A、C或G、T错配

互变异构移位第七页，共九十五页。

主要指胞嘧啶C、A和G分子结构中都含有环外氨基，氨基有时会自动脱落，使得C变为U，A变为I，G变为X，当DNA复制时，会在链中产生错误导致损伤。A—I—C(非T)下一轮C—G导致AT—GC引起突变C—U–A(非G)下一轮A—T导致GC—AT引起突变

亚硝酸盐、羟胺诱变剂脱氨试剂第八页，共九十五页。

DNA复制时，无论模板还是新生链都会发生碱基的环出现象，即DNA聚合酶发生“打滑”，引起一个或数个碱基的插入或缺失。尤其是模板上有几个相同的碱基情况。DNA聚合酶的“打滑”第九页，共九十五页。细胞的氧化代谢产生的氧自由基活性很高，DNA碱基至少会遭受到20种氧化损伤。活性氧为氧分子电子数大于O2的O2-

可与

C、A配对，DNA聚合酶不能矫正其错误，造成GC—TA颠换，这种损伤可以积累，损伤的碱基也能够被修复。活性氧引起的诱变第十页，共九十五页。DNA分子在生理条件下可通过自发性水解，使嘌呤碱和嘧啶碱从磷酸脱氧核糖骨架上脱落下来。哺乳动物每个细胞每20h脱去的嘌呤碱和嘧啶碱数分别平均为1000个和500个。碱基丢失第十一页，共九十五页。

紫外线(UV)照射引起的DNA损伤主要是同一条链内相邻2个嘧啶形成嘧啶二聚体，阻碍DNA的复制和转录。

ATTCGAGTTAGCTAAGCTCAATCG

5.1.2物理因素引起的损伤第十二页，共九十五页。第十三页，共九十五页。当人的皮肤暴露在紫外线下，每小时产生5×104嘧啶二聚体/细胞第十四页，共九十五页。

1．皮肤癌主要见于经常暴露于阳光的部位，尤其是头颈部、手臂及手。

2．鳞癌好发于阳光照射最多的部位。

3．户外工作时间较长的人群中皮肤癌发病率较高。

4．在同肤色人群中，居住于低纬度地区者，皮肤癌和恶性黑色素瘤发病数显著增多，其他恶性肿瘤则无此倾向。

5．易感人种，典型的易感者为皮肤色素少或有散在的雀斑，易受阳光的灼伤。

第十五页，共九十五页。直接效应高能r射线和X射线辐射后，对DNA存在环境的成分沉积能量，直接引起DNA理化性质改变间接效应细胞水分解离，产生氧自由基诱变碱基改变辐射后DNA分子碱基糖环发生变化，生成各种过氧化物，使碱基破坏或脱落脱氧戊糖受OH-作用，脱氢原子，使其分解引起DNA链断裂引起DNA链断裂及DNA链间交联，DNA-蛋白交联等电离辐射引起DNA损伤第十六页，共九十五页。非电离辐射第十七页，共九十五页。第十八页，共九十五页。烷化剂对DNA的损伤烷化剂是一类亲电子化合物，很容易与体内大分子负电中心作用。当烷化剂和DNA作用时，可以将烷基加到核酸的碱基上去。结果是形成链内或链间交联，引起DNA烷基化。

6.1.3化学因素引起的损伤第十九页，共九十五页。碱基类似物对DNA的损伤是一类结构与碱基相似的人工化合物，由于结构相似，进入细胞后能代替正常碱基掺入到DNA中，干扰DNA合成。5-溴尿嘧啶（5-BU）与U结构类似，酮式能与A配对，烯醇式能与G配对。结果引起A-T----G-C转变。第二十页，共九十五页。

DNA修复是生物体细胞在长期进化中形成的一种保护功能，在遗传信息传递的稳定性方面具有重要作用。5.2DNA的修复第二十一页，共九十五页。直接修复切除修复错配修复重组修复易错修复和SOS应急反应细胞DNA损伤的修复系统主要有：第二十二页，共九十五页。直接修复将被损伤碱基回复到正常状态的修复包括光复活修复、O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶修复、单链断裂修复在DNA光解酶(Photolyase)的作用下将在光下或经紫外光照射形成的环丁烷胸腺嘧啶二体及6-4光化物(6-4photoproduct)还原成为单体的过程。生物体内还广泛存在着使O6-甲基鸟嘌呤脱甲基化的甲基转移酶，以防止形成G-T配对。DNA单链断裂可以通过重接（DNA连接酶），直接修复。第二十三页，共九十五页。第二十四页，共九十五页。切除修复

包括碱基切除修复和核苷酸片段切除修复碱基切除修复：所有细胞中都带有能识别受损核酸位点的糖苷水解酶，它能特异性切除受损核苷酸上的N-β－糖苷键，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点（AP位点）。DNA分子中一旦产生了AP位点，AP核酸内切酶就会把受损核苷酸的糖苷-磷酸键切开，并移去包括AP位点核苷酸在内的小片段DNA，由DNA聚合酶I合成新的片段，最终由DNA连接酶把两者连成新的被修复的DNA链。第二十五页，共九十五页。

核苷酸片段切除修复

当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤，导致双链之间无法形成氢键，则由核苷酸切除修复(nucleotide-excisionrepair)系统负责修复。第二十六页，共九十五页。损伤发生后，首先由DNA切割酶(exci-nuclease)在已损伤的核苷酸5’和3’位分别切开磷酸糖苷键，产生一个12～13个核苷酸(原核生物)或27～29个核苷酸(人类或其他高等真核生物)的小片段，移去小片段后由DNA聚合酶Ⅰ(原核)或ε(真核)合成新的片段，并由DNA连接酶完成修复中的最后一道工序。第二十七页，共九十五页。第二十八页，共九十五页。错配修复错配修复可以将DNA子链中的错配几乎完全修复。该系统识别母链依赖Dam甲基化酶，它能使位于5’GATC序列中A的N6位甲基化。一旦复制叉通过复制起始位点，母链就会在开始DNA合成前的一小点时间（几秒钟至几分钟）内被甲基化。第二十九页，共九十五页。此后，只要两条DNA链上碱基配对出现错误，错配修复系统就会根据“保存母链，修正子链”的原则，找出错误碱基所在的DNA链，并在对应于母链甲基化腺苷酸上游G的5'位置切开子链。第三十页，共九十五页。第三十一页，共九十五页。第三十二页，共九十五页。切除修复发生在下一轮DNA修复前，又称复制前修复。机体细胞对在复制起始时尚未修复的DNA损伤部位可以先复制再修复，这种方式称为重组修复。这个过程发生在复制后，又称复制后修复。重组修复第三十三页，共九十五页。复制重组再合成第三十四页，共九十五页。重组修复机制的缺陷，有可能导致肿瘤发生。已经发现，妇女Brca1和Brca2两个基因如果有缺陷，发生乳腺癌的概率为80%。这两个蛋白质参与重组修复。

第三十五页，共九十五页。错配修复、直接修复、切除修复和重组修复都能够识别DNA的损伤部位或错配碱基而加以消除，在这些修复过程中不引入错误碱基，属于避免差错的修复。易错修复和SOS应急反应第三十六页，共九十五页。当无法为修复提供正确模板时，如模板链损伤、双链断裂、双链交联等，正常复制受阻，导致易错修复。许多能造成DNA损伤或抑制DNA复制的过程能引起一系列复杂的诱导效应，这种效应称为应急反应(SOSresponse)。SOS包括诱导DNA损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制以及溶源性细菌释放噬菌体等，细胞癌变也与SOS反应有关。第三十七页，共九十五页。SOS反应是细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，细胞为求生存而产生的一种应急措施。SOS反应诱导的修复系统包括：避免差错的修复（errorfreerepair）和易产生差错的修复（errorpronerepair）两类。第三十八页，共九十五页。由于SOS反应还能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，所以在DNA链的损伤部位即使出现不配对碱基，复制也能继续进行，以保证细胞的存活，叫易产差错的修复。第三十九页，共九十五页。SOS反应广泛存在于原核和真核生物，它是生物体在不利环境中求得生存的一种基本功能。SOS反应意义：①DNA的修复；②导致变异。第四十页，共九十五页。作为遗传物质的DNA有三个主要功能：①通过复制将遗传物质由亲代传给子代；②通过转录使遗传信息在子代得以表达；③通过变异在自然过程中获得新的遗传信息。5.3基因突变第四十一页，共九十五页。基因突变(mutation)：是在基因发生可遗传的结构和数量的变化，通常产生一定的表型。广义的突变包括染色体畸变和基因突变。遗传重组也导致可遗传的变异，因此，染色体畸变、基因突变、遗传重组是可遗传变异的基础。第四十二页，共九十五页。1、碱基对置换：指DNA错配对碱基在复制后被固定下来，由原来的一个碱基对被另一个碱基对所取代，又称为点突变。碱基对置换有转换和颠换两种。2、插入突变：指在基因的序列中插入了一个碱基或一段外来DNA导致的突变。包括同义突变、错义突变和无义突变。基因突变的类型第四十三页，共九十五页。3.移码突变：一个或多个非三整倍数的核苷酸对插入或缺失，导致编码区位点后的三联体密码子可读框改变，从而使后面的氨基酸都发生错误，是基因产物失活。4.渗漏突变：突变基因的产物尚有部分活性的错义突变。5.回复突变：从突变体回复原先野生型表型的突变过程。第四十四页，共九十五页。在自然条件下发生的突变称为自发突变。自发突变的频率很低，大肠杆菌及果蝇突变率10-10左右。能够提高突变率的物理或化学因子称为诱变剂(mutagen)。碱基类似物：5-BU与T结构相似；碱基修饰剂：亚硝酸；烷化剂；嵌合染料(EB)；紫外线和电离辐射诱变剂种类及机制第四十五页，共九十五页。生物功能丧失获得新功能癌症发生基因突变的主要后果第四十六页，共九十五页。课后作业名词解释：基因突变无义突变移码突变回复突变简答题：课后思考题1和4第四十七页，共九十五页。DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组或基因重排。重组产物称为重组DNA(recombinantDNA)。真核生物基因组间重组多发生在减数分裂时同源染色体之间的交换。细菌及噬菌体的基因组为单倍体，来自不同亲代两组DNA之间可通过多种形式进行遗传重组。第6章DNA的重组与转座第四十八页，共九十五页。DNA重组对生物进化起着关键性的作用。可遗传变异的根本原因是突变。突变的概率很低，且多数是有害的。如果生物只有突变没有重组，在积累具有选择优势突变的同时不可避免地积累许多难以摆脱的不利突变。有利突变随不利突变一起被淘汰，新的优良基因就不可能出现。DNA重组的意义是能迅速增加群体的遗传多样性，使有利突变与不利突变分开，通过优化组合积累有意义的遗传信息。此外，DNA重组还参与许多重要生物学过程，为DNA损伤或复制障碍提供了修复机制。第四十九页，共九十五页。DNA重组分为4类：同源重组：重组对之间需要同源性位点特异重组：无需同源性，调节蛋白识别特异DNA序列转座重组：无需同源，调节蛋白识别转座因子异常重组：无需同源或少同源性，属非正常细胞行为第五十页，共九十五页。同源重组：由两条同源区的DNA分子，通过配对、链断裂和再连接而产生的片段间交换的过程。

6.1.1同源重组的分子模型

Holliday等1964年提出，能够较好解释同源重组现象。6.1同源重组第五十一页，共九十五页。两条同源染色体DNA相互靠近排列2.两个同源DNA分子之一发生断裂3.断裂后形成3’游离端侵入双链DNA，寻找同源区，形成短的链置换区4.形成Holliday中间体5.引发分支迁移6.四链DNA复合体按不同方向拆分，形成片段重组体和拼接重组体第五十二页，共九十五页。6.1.2同源重组的酶学分子机制6.1.3酵母的减数分裂重组6.1.4异源双链与基因转换

在重组区段每条双链中均有一段DNA单链来自另一双链中的相对链，这一部分称为异源双链。了解第五十三页，共九十五页。细菌可以通过多种途径进行细胞间基因转移，并通过基因重组适应环境改变。这种遗传信息的流动可以发生在种间和种内，甚至与高等动植物之间也存在横向的遗传信息传递。细菌的基因转移主要有四种机制：接合(conjugation)转化(transformation)转导(transduction)细胞融合（cellfusion）6.1.5细菌的基因转移与重组第五十四页，共九十五页。①细菌的接合细菌细胞相互接触时遗传信息可由一个细胞转移到另一细胞，称为接合作用。供体细胞为雄性，受体为雌性。通过接合而转移DNA的能力由接合质粒提供，与接合功能有关的蛋白质均由接合质粒所编码。能够促使染色体基因转移的接合质粒称为致育因子(fertilityfactor，F因子)。第五十五页，共九十五页。大肠杆菌F因子是双链闭环的大质粒，总长约100kb，复制起点为oriV。F因子可以在细胞内游离存在(F+)，也可以整合到宿主染色体内。整合F因子的大肠杆菌菌株具有较高频率的重组(high-frequencyrecombination)，称为Hf菌株。F因子可以整合在染色体不同位置，由此而得到不同的Hf菌株。第五十六页，共九十五页。②细菌的遗传转化遗传转化(genetictransformation)是指细菌品系由于吸收了外源DNA（转化因子）而发生遗传性状的改变现象。第五十七页，共九十五页。感受态细胞（competentcell）：具有摄取周围环境中游离DNA分子能力的细菌细胞称为感受态细胞。受体细胞经过一些特殊方法（如电击、CaCl2）处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的状态。第五十八页，共九十五页。③细菌的转导转导(transduction)：是通过噬菌体将细菌基因从供体转移到受体细胞的过程。④细菌的细胞融合由细胞质膜融合导致的基因转移和重组。在实验室中用溶菌酶除去细菌细胞壁的肽聚糖，使其成为原生质体，可人工促进原生质体融合，由此使两菌株的DNA发生广泛的重组。第五十九页，共九十五页。6.2特异位点重组广泛存在于各类细胞中，有特殊的作用，包括某些基因表达的调节，发育过程中程序性DNA重排，以及有些病毒和质粒DNA复制循环过程中发生的整合与切除等。一般发生在某个特定的（重组位点）短DNA序列（20-200bp）内，有特异的酶和辅助因子对其识别和作用。第六十页，共九十五页。1.λ噬菌体DNA的整合与切除2.鼠伤寒沙门氏菌的特异位点重组第六十一页，共九十五页。6.3.1转座子的概念转座子（transposon）：是在基因组中可以移动的一段DNA序列。一个转座子由基因组的一个位置转移到另一个位置的过程称为转座或移位(transposition)。本质是由转座子（可移位因子）介导的遗传物质重排现象。6.3DNA的转座第六十二页，共九十五页。早在20世纪初，遗传学家就已发现玉米中存在决定体细胞变异的控制因子（controllingelement），事实上就是转座子。第六十三页，共九十五页。20世纪40年代，巴巴拉．麦克林托克（BarbaraMcClintock）在美国康奈尔大学和冷泉港实验室所进行的开创性工作，在印第安玉米研究中发现了转座子，当时称控制元件，打破了孟德尔关于基因固定排列于染色体上的概念，在当时几乎不能被科学界所接受。直到1983年终于在分子水平上得到证实，并使她获得了诺贝尔生理与医学奖。第六十四页，共九十五页。转座子存在于地球上所有生物体内人类基因组中有35%以上序列为转座子序列，大部分与疾病有关（基因重排，影响基因组稳定性，导致疾病）。第六十五页，共九十五页。6.3.2转座子的分类插入序列复合转座子第六十六页，共九十五页。

（1）插入（IS）序列

最简单的转座子只含有与转座有关的酶基因，不含有任何宿主基因（不含抗药性基因），常被称为插入序列(insertionsequence，IS)。

IS序列都是可以独立存在的单元，它们都是很小的DNA片段(约lkb)，带有介导自身移动的蛋白，两端具有15~25bp的反向重复序列，转座时往往复制宿主靶位点一小段(4～15bp)DNA，形成位于IS序列两端的正向重复区

。第六十七页，共九十五页。第六十八页，共九十五页。IS常常插入到特定的基因中，造成该基因突变。科学上用标准命名法对这些突变进行编号，如λ::IS1表示一个IS1的序列插入到噬菌体λ基因组内。第六十九页，共九十五页。表2-13IS序列的结构特征长度/bp两端倒置重复区/bp靶位点正向重复区/bp靶位点IS1IS2IS4IS5IS10RIS50RIS90376813271428119513291531105723411816229189511或124999随机有热点AAAN20TTT有热点NGCTNAGCN有热点未知第七十页，共九十五页。（2）复合转座子复合转座子(compositetransposon)：是一类除了转座酶基因之外，还带有药物抗性基因(或其他宿主基因)标志的转座子。因结构较大而复杂，故称为复合转座子。以Tn表示。第七十一页，共九十五页。两个末端有相同的IS序列，IS序列有正向和反向两种排列方式。表明IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。Ⅰ型：第七十二页，共九十五页。第七十三页，共九十五页。一旦形成复合转座子，IS序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只有作为复合体移动。第七十四页，共九十五页。

Ⅱ型主要指TnA家族:没有IS序列、体积庞大(5000bp以上)、带有3个基因，其中一个编码β-内酰胺酶(AmpR)，另两个则是转座作用所必须的。这类转座子两翼带有38bp的倒置重复序列。

第七十五页，共九十五页。第七十六页，共九十五页。复合转座子（Tn）的特点①末端反向重复序列，为转座酶所必须；②中间的开放阅读框架（ORF）作为标记基因；③转位后靶位点成为正向重复序列。第七十七页，共九十五页。第七十八页，共九十五页。6.3.3转座子的转座机制转座时发生的插入作用的普遍特征是受体分子中有一段很短的(3～l2bp)、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。第七十九页，共九十五页。对于一个特定的转座子来说，它所复制的靶序列长度是一样的，如IS1两翼总有9个碱基对的靶序列，而Tn3两端总有5bp的靶序列。靶序列的复制起源于特定内切酶所造成的粘性DNA末端。第八十页，共九十五页。第八十一页，共九十五页。6.3.4转座子的基本特征转座不依赖RecA转座后靶序列重复转座子有插入选择性区域性优先转座具有排他性转座有极性效应活化临近的沉默基因第八十二页，共九十五页。6.3.4转座作用的遗传学效应(1)转座引起插入突变（10-8~10-3）各种IS、Tn都可以引起插入突变。如果插入位于某操纵子的前半部分，就可能造成极性突变，导致该操纵子后半部分结构基因表达失活；(2)转座产生新的基因如果转座子上带有抗药性基因，它一方面造成靶DNA序列上的插入突变，同时也使这个位点产生抗药性；第八十三页，共九十五页。(3)影响插入位置邻近基因的表达，使宿主表型改变;(4)转座子插入染色体后引起两侧染色体畸变;第八十四页，共九十五页。转座子在分子生物学中的作用用于难筛选的基因转移基因定位的标记筛选插入