（正式版）DB15∕T 536-2013 《绵羊肺腺瘤病的检测方法 PCR方法》

备案号：36653~2013绵羊肺腺瘤病的检测方法PCR方法2013-03-20实施2013-03-20实施DB15/T536--2013本标准等效采用了OIE中Chapter2.7.10OvinepulmonaryAdenocarcinoma(adenomatosis)推荐使用的方法。本标准的附录A和附录B为资料性附录。木标准由内蒙古出入境检验检疫局提出并负责解释。本标准起草单位：内蒙古出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王海艳、赵治国、敖威华、赵林立、郭铁筝、潘国卿、马彩霞、李刚。本标准规定了绵羊肺腺瘤病的检测方法。本标准适用于血液及支气管肺泡中绵羊肺腺瘤病2规范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于木文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(egvISO3696:1987)GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求3术语和定义3.1聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)用于扩增位于已知序列之间DNA(deoxyribonucleosideaacid,脱氧核糖核酸)的方法。模板DNA3.3bp:bascpai3.5dNTPs:dATP(deoxyadenosinetriphosphate,(dcoxyguanosinetriphosphate,脱氧岛苷三磷酸)。4检测过程中防止交叉污染的措施5试剂和材料2除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验川水符合GB/T6682的要求。5.1绵羊肺腺瘤病检测引物(对)序列：见附录A.1。5.32%氨苯异丁酯。5.4生理盐水：见附录A.2。5.8分子量标准品(100bp~2000bp)。5.9TE缓冲液。5.11电泳缓冲液：见附录A.3。5.12溴化乙锭贮存液：见附录A.4。5.13加样缓冲液：见附录A.5。6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.9天平：感量0.01g。7.1血液样品37.2支气管肺泡灌洗样品(Bronchoalveolarlavage,BAL)静脉注射盐酸氯胺酮(8～10mg/kg休重)麻醉待检动物，利用胸骨板保定动物，并将其头部仲直使口腔和喉部排列为一条直线，使喉部在喉镜中完全可见并利用麻醉剂(2%氨苯异丁酯)局部喷雾麻醉。将…根长约30～40cm的PVC透明管(直径0.8cm,壁厚2mm)置入喉部，将一根长约100cm的饲管通过PVC管伸入到气管，直到难以继续深入面到达支气管，利用4份25ml,灭菌生理盐水灌洗，收集灌洗液并将其保存于-20℃待用。为了避免操作过程不同样晶的交义污染，对丁每一个动物，操作者需要更换乳胶手套和…次性用品，对每一个动物所用的喉镜、压舌板、和喷雾装置进行清理和消毒。8.1样品处理血液样品：将采集的抗凝血L10mL在室温下2000g离心15min,利用无菌吸管将自细胞层小心移BAL样品：将支气管肺泡灌洗液在4℃下200g离心10min,弃去大部分上清液，用剩余的少量上：清液将细胞沉淀混匀，并移入另一微量离心管。室温下，16000g离心1min后弃上清，将细胞沉淀于80℃保存待用。8.2样品的总DNA提取利用试剂盒Dneasytissuck也可以采用与Dneasytissuekit等效的方法提取绵羊肺腺瘤病毒DNA。和280nm处的吸光值A260和A₂80。DNA的浓度按公式(1)计算：PCR反应体系体积为50μL,休系组成见表1。4贮备液浓度(pmol/L)加入PCR反应体系的体积(μul.)10×PCR反应缓冲液一5PorF引物2222PCR反应条件：94℃预变性10min;94℃变性1min,59℃退火1min,72℃延伸1min,30个循环；72℃延伸3min;4℃保存。检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含绵羊肺腺瘤病毒成分的样品作阳I性制胶。在电泳槽中加入电冰缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5μL~8μL,PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合点样。9Vlem恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移9.1结果判定9.1.1对照结果9.2结果表述检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。6(资料性附录)试剂配制A.1绵羊肺腺瘤病检测引物(对)序列为：PorI':5'-TGGGAGCTCTTTGGCAPorR:5'-CACCGGATTTTTACACAATCACCGG3'A.2生理盐水：称取9gNaC1,溶于1000ml,蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。A.3电泳缓冲液：Tris54g,硼酸27.5g,0.5mol/L,TIi缓冲液(pll8.0)20mL,加蒸馏水至1000mL;使用时10倍稀释。A.4溴化乙锭贮存液：用水配制成10mg/mL。A.5加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，质量浓度为40%的蔗糖水溶液。配制方法：称取溴酚蓝0.125g,加双蒸水5mL,室温下过夜，待其溶解后，称取蔗糖20g加入到溴酚蓝溶液中，摇匀定容至50mL.,加入一滴氢氧化钠溶液，调至蓝色。(资料性附录)PCR产物测序结果TGGGAG