木霉属 DK 菌剂生产应用技术规范

1T/QAS***-2025T/QHNX***－2025木霉属DK菌剂生产应用技术规范本文件规定了Trichodermasp.DK菌剂术语和定义、生产场地及环境、培养基质及配方、菌种发酵液生产、发酵液施用方法、种植环境、应用植物、禾本科作物田间管理、牧草地管理、采收、菌剂生产质量要求、生产记录与存档等要求。本文件适用于促进部分禾本科植物（同德短芒披碱草Elymusbreviaristatuscv.Tongde、青海中华羊茅FestucasinensisKengcv.Qinghai、青海冷地早熟禾PoacrymophilaKengcv.Qinghai、青海草地早熟禾PoapratensisL.cvQinghai、燕麦AvenasativaL.、小麦TriticumaestivumL、青稞Hordeumvulgarevar.coelesteL.）生长与增强抗逆性。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，标注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；未标注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB150.1压力容器第1部分：通用要求GB2715食品安全标准粮食GB5084农田灌溉水质标准GB5749生活饮用水卫生标准GB/T8321（所有部分）农药合理使用标准GB15618土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）GB20287农用微生物菌剂GB50073洁净厂房设计规范NY/T883农用微生物菌剂生产技术规程3术语和定义GB20287-2006界定的术语和定义适用于本文件。3.1Trichodermasp.DK纯化后的菌株菌落整体白色，圆形、菌丝呈干燥绒状边缘不规则，有隔菌丝，无孢子。菌落背面背面整体颜色一致，为淡粉色。菌丝直径为：5.65±0.132(μm），符合木霉属特征，将菌株编号为DK。ITSDNA序列信息>KR995112.1TrichodermarossicumisolateBK0618SribosomalRNAgene,partialsequence;internaltranscribedspacer1,5.8SribosomalRNAgene,andinternaltranscribedspacer2,completesequence;and28SribosomalRNAgene,partialsequenceT/QAS***-2025T/QHNX***－20252GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGCGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTACTTCTGAGAATTTCTCGGCGCCCCTAGTGGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTTTCACCGGGTGCCGGCCCCTAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCATGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGANCBI登录号：KR995112.1。CGMCCNo.409324生产场地及环境4.1厂房从布局结构功能上应满足液体品种生产的基本需求，主要分区之间应相互独立隔离。4.2主要分区应包括化验室、菌种室、接种间、培养间、配料间、发酵间和其他配套功能间。4.3厂房周围交通便利，无污水和其他污染源，卫生环境应符合NY/T883和GB50073相关要求。5培养基质及配方5.1原料5.1.1菌株：Trichodermasp.DK。5.1.2菌种培养基质包括固体和液体培养基：马铃薯、葡萄糖、琼脂，蒸馏水。5.1.3一级种子培养基质：马铃薯、葡萄糖、蒸馏水。5.1.4二级种子培养基质：马铃薯、葡萄糖、蒸馏水。5.1.5三级种子培养基质：马铃薯、葡萄糖、蒸馏水。5.1.6发酵液培养基质：马铃薯、葡萄糖、水。5.2原料要求菌株要求无其他杂菌污染；马铃薯质量要求符合GB2715，葡萄糖符合NY/T883的相关要求。5.3配方PDA固体培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。PDA液体培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。6菌种发酵液生产6.1培养液制备T/QAS***-2025T/QHNX***－202536.1.1一级和二级种子培养基配制方法如下：先洗净去皮切碎，称取马铃薯并煮烂（煮沸半个小时左右，能被玻璃棒戳破即可），用八层纱布过滤，纱布的孔径为60μm，分装到1000mL三角瓶中，装量为200mL/1000mL。6.1.2种子罐和发酵罐培养基配制方法如下：先洗净马铃薯，在清洗过程中尽量去除掉皮，切碎后称取马铃薯并煮烂（煮沸半个小时左右，能被玻璃棒戳破即可），用八层纱布过滤，加入到罐中定容。6.2灭菌高压蒸汽灭菌锅应符合GB150.1要求，115°C灭菌20min，冷却后等待备用。6.3一级种子的制备在无菌室的超净工作台中，用灭菌的接种环刮一环带有菌丝的DK菌株斜面转接至PDB培养基中，25℃静置培养3d左右（黑暗）。6.4二级种子的制备种子为一级种子，接种量为5%，在170r·min-1的摇床上25℃培养大约在48h时，pH达到3.3-3.4、菌丝干重达到0.35g/100mL。6.5三级种子制备把培养好的二级种子按5%接种量接入到种子罐中，pH调到4左右，通风比（每min每单位体积发酵液通入空气的体积）为0.5L/(L·min)，罐压为0.05MPa，溶氧≥30%，25℃培养33h左右，菌丝干重达到0.35g/100ml发酵液，pH为3.67（滤液）作为种子备用。6.6发酵液生产将培养好的三级种子液按5%接种量接入到发酵罐中，pH调到4左右，通风比（每分钟每单位体积发酵液通入空气的体积）为0.7L/(L·min)，罐压为0.05MPa，溶氧≥30%，25℃培养40h左右，菌丝干重达到0.45g/100ml发酵液，pH为3.45左右（滤液），发酵结束。6.7放罐准备终止发酵后需运输则在培养器内通入无菌二氧化碳，2h，清除发酵液中氧气，减少运输过程中的DK菌的二次生长，装储液罐运输，长途运输需要透气盖，以防运输过程胀罐，菌液溢流。7发酵液施用方式7.1浸种7.1.1菌株发酵液首先利用干净水（生活饮用水卫生标准）进行5~10倍稀释。7.1.2按稀释液（L）与燕麦种子（kg）为1：1(v/m)充分混合，并浸泡6h，去除菌液，自然阴干种子后种植。7.1.3根据地方高产标准，种子用量为15kg/亩。7.2拌种按发酵液（L）与燕麦种子（kg）为1：4(v/m)的比例进行充分混合。具体的操作方法如下：T/QAS***-2025T/QHNX***－20254a)根据燕麦种子的重量确定菌株发酵液的用量；b)将发酵液均匀地浇洒燕麦种子，翻转均匀，使得种子表面充分浸湿后堆放6h，晒干种子后种植；c)种子用量为15kg/亩。7.3拌料7.3.1将羊板粪：发酵液按1m3:1L比例充分混匀后，均匀施用于地表，经机械翻耕（深度20cm）使得肥土混合均匀。7.3.2采用机械撒播的方式播种禾本科牧草：同德短芒披碱草、青海中华羊茅、青海冷地早熟禾和青海草地早熟禾，牧草种子用量为6kg/亩。7.4堆肥7.4.1按羊板粪重量加入5~10%DK发酵液(m/v)，搅拌混匀后堆积发酵液，用直径5cm的木棒在发酵堆顶部垂直向下打2排透气孔，孔间距约为5cm，在羊板粪堆肥表面覆盖塑料薄膜，在塑料薄膜侧面开4个通风口，以防止堆肥过程中的水分大量蒸发和降雨天气。7.4.2控制羊板粪堆肥中水分保持在60%左右，发酵过程中菌渣堆肥每15d翻一次。7.4.3发酵堆肥时长为30d。7.4.4发酵结束后均匀施用于地表，经机械翻耕（深度20cm）使得肥土混合均匀。7.4.5采用机械撒播的方式播种禾本科牧草：同德短芒披碱草、青海中华羊茅、青海冷地早熟禾和青海草地早熟禾，牧草种子用量为6kg/亩。8种植环境8.1土壤要求以沙土、沙壤土为主的土壤，土壤pH值8~9，呈中性或弱碱性为宜。土壤环境质量符合GB15618的要求。8.2种植场处理在早春进行种植场翻耕，翻耕时清除杂草、灌木。8.3种植季节不同产区栽培季节存在差异，4~6月可种植。9应用植物采用机械播种，用量如下：a)牧草种子用量为6kg/亩；b)燕麦种子为15kg/亩；c)小麦种子为15kg/亩；d)青稞种子15kg/亩。T/QAS***-2025T/QHNX***－2025510禾本科作物田间管理10.1灌溉、施肥和除虫等均按地方高产标准对田间进行管理。10.2田间灌溉应符合GB5084。10.3农药使用应符合GB/T8321。11牧草地管理11.1种植后无纺布覆盖。11.2种植场周围建围栏防治人、畜踩踏危害。11.3灌溉、追肥和除虫等均不进行人为干预。12采收12.1采收时间按植物用途适时安排采收，选择晴天或阴天进行，忌雨天采收。12.2采收标准12.2.1牧草：抽穗期至开花期采收较为适宜。12.2.2燕麦：籽粒由绿色变为黄色或浅褐色，且大部分籽粒颜色均匀一致；燕麦穗部的小穗轴由绿色变为黄色，且小穗上的颖壳张开；乳线消失；出现黑层。12.2.3小麦：麦粒由绿色逐渐变为深浅不同的黄色或橘黄色，麦粒颜色均匀一致；麦穗整体变黄，麦芒干枯，小穗基部的节片呈浅黄色；用手挤压麦粒，感觉坚硬，不易变形；茎杆变黄，叶片大部分枯黄。12.2.4青稞：青稞穗部由绿色转为黄色或淡黄色，且颜色均匀一致；用手挤压籽粒，感觉坚硬，不易变形；乳线消失；黑层形成。13菌剂生产质量要求13.1菌剂质量检测方法取100mL发酵液，利用滤纸过滤菌剂，使得发酵液内的滤液和菌体分离。然后测量滤液的pH，于恒温烘箱内60℃烘干菌体，恒重时用电子天