CN120204415A 一种基于核糖体亲和的用于肿瘤光动力治疗的荧光纳米碳点、制备及应用

(19)国家知识产权局1037号(72)发明人邹佳华黎勇樊锦轩赵元弟A61K47/59(2017.01)A61K47/54(2017A61PA61KB82YB82YB82YB82Y 一种基于核糖体亲和的用于肿瘤光动力治疗的荧光纳米碳点、制备及应用(57)摘要本发明公开了一种基于核糖体亲和的用于肿瘤光动力治疗的荧光纳米碳点、制备及应用，21.一种基于核糖体亲和的荧光纳米碳点的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将左氧氟沙星、甲苯胺蓝和聚乙烯亚胺的混合溶液进行加热以形成纳米碳点；所述甲苯胺蓝作为碳点形成的碳核；所述聚乙烯亚胺作为阳离子聚合物使得碳点表面带有正电荷；所述左氧氟沙星修饰在所述碳点表面，所述左氧氟沙星用于靶向糙面内质网上的核糖(2)将步骤(1)得到的溶液通过水系过滤器滤除不溶物质并保留过滤液；然后使用透析膜进行透析，即得到基于核糖体亲和的用于肿瘤光动力治疗的荧光纳米碳点。2.如权利要求1所述的基于核糖体亲和的荧光纳米碳点的制备方法，其特征在于，所述混合溶液中，左氧氟沙星、甲苯胺蓝和聚乙烯亚胺三者的质量之比为(2-4):(10-15):(1-3.如权利要求1所述的基于核糖体亲和的荧光纳米碳点的制备方法，其特征在于，所述加热的方式为微波加热，加热的功率为500W-700W,加热的时间为5min-10min。4.如权利要求1-3任意一项方法制备得到的基于核糖体亲和的荧光纳米碳点。5.如权利要求4所述的基于核糖体亲和的荧光纳米碳点，其特征在于，所述荧光纳米碳点的粒径范围为1nm-10nm。6.如权利要求4所述的基于核糖体亲和的荧光纳米碳点，其特征在于，所述荧光纳米碳点的表面电势范围为20mV-40mV。7.如权利要求4-6任意一项所述的基于核糖体亲和的荧光纳米碳点用于制备肿瘤光动力治疗试剂的应用。8.如权利要求4-6任意一项所述的基于核糖体亲和的荧光纳米碳点用于制备成像试剂的应用。3点、制备及应用技术领域[0001]本发明涉及亚细胞器成像和光动力治疗领域，更具体地，涉及一种基于核糖体亲和的用于肿瘤光动力治疗的荧光纳米碳点、制备及应用，尤其涉及一种基于左氧氟沙星对核糖体特异性亲和能力的具有光动力功能的碳点制备及应用。背景技术[0002]核糖体作为蛋白质的翻译和转运的场所，其功能的损伤、修复与调控直接影响着细胞的表型与生理状态，并进一步影响着包括肿瘤在内的多种疾病。细胞中蛋白的合成均起始于核糖体通过其大小亚基与mRNA结合，N端信号肽在初期被核糖体翻译后与核糖体的大小亚基共同被细胞基质中的信号识别颗粒(SRP)识别，随后主动运输至糙面内质网附近，并由SRP识别糙面内质网膜上的SRP受体，从而驻留于内质网，随着翻译完成后核糖体即离开糙面内质网。核糖体具有高度复杂的三维结构，其为mRNA、tRNA以及肽链等提供结合位点，同时也为多种特异性亲和分子提供靶点。[0003]传统核糖体主动靶向颗粒以核酸序列对核糖体RNA的配对靶向或对受体结合的原理来设计，受限于细胞内多种细胞器和复杂的运输环境以及受体的低特异性的影响，靶向精准度不足。因此设计一种新的核糖体靶向机制，并用于精准成像和高效光动力治疗仍然是一个巨大的挑战。发明内容[0004]针对现有内质网药物精准递送不足的问题，本发明提供了一种基于左氧氟沙星对核糖体特异性亲和能力的细胞核糖体纳米碳点，使用左氧氟沙星、甲苯胺蓝和聚乙烯亚胺作为原料，通过加热合成了具有荧光的碳点。本发明中左氧氟沙星修饰碳点表面，用于结合定位于糙面内质网的核糖体；甲苯胺蓝作为光敏剂在碳点合成中作为碳核，有助于碳点的形成，部分甲苯胺蓝分布于碳点表面，提供光动力治疗效果，且其具有共轭结构，赋予碳点良好的荧光特性；聚乙烯亚胺作为阳离子聚合物，使得碳点表面带有合适的正电荷，有助于细胞对碳点的快速摄取。[0005]根据本发明第一方面，提供了一种基于核糖体亲和的荧光纳米碳点的制备方法，包括以下步骤：(1)将左氧氟沙星、甲苯胺蓝和聚乙烯亚胺的混合溶液进行加热以形成纳米碳点；所述甲苯胺蓝作为碳点形成的碳核；所述聚乙烯亚胺作为阳离子聚合物使得碳点表面带有正电荷；所述左氧氟沙星修饰在所述碳点表面，所述左氧氟沙星用于靶向糙面内质网上的核糖体；(2)将步骤(1)得到的溶液通过水系过滤器滤除不溶物质并保留过滤液；然后使用透析膜进行透析，即得到基于核糖体亲和的用于肿瘤光动力治疗的荧光纳米碳点。[0006]优选地，所述混合溶液中，左氧氟沙星、甲苯胺蓝和聚乙烯亚胺三者的质量之比为4[0007]优选地，所述加热的方式为微波加热，加热的功率为500W-700W,加热的时间为5米碳点。[0009]优选地，所述荧光纳米碳点的粒径范围为1nm-10nm。[0010]优选地，所述荧光纳米碳点的表面电势范围为20mV-40mV。[0011]根据本发明另一方面，提供了任意一项所述的基于核糖体亲和的荧光纳米碳点用于制备肿瘤光动力治疗试剂的应用。[0012]根据本发明另一方面，提供了任意一项所述的基于核糖体亲和的荧光纳米碳点用于制备成像试剂的应用。[0013]总体而言，本发明中所设计的以上技术方案与现有的光动力治疗探针相比，具备以下的原理和技术优点：(1)左氧氟沙星在细菌中通过结合核糖体的功能位点实现干扰蛋白合成来杀灭细[0015](3)本发明以左氧氟沙星对核糖体的亲和，对真核生物毒性低；利用细菌和哺乳动物核糖体的结构与构象的差异，实现对真核细胞核糖体的精准亲和，同时避免了对正常细胞核糖体功能的干扰，最大程度降低了探针的生理毒性。[0016](4)本发明提出新的真核细胞内质网的靶向技术，以左氧氟沙星结合富集于糙面内质网的核糖体，从而靶向内质网，具备示踪能力。[0017](5)本发明制备方法简单，一步微波法或一步水热合成，合成条件简单。[0018]图1为本发明所述纳米碳点的合成流程示意图。[0019]图2为本发明一种基于核糖体亲和用于肿瘤光动力治疗的纳米碳点在细胞内结合核糖体并靶向内质网的流程图。[0020]图3为本发明所述荧光碳点透射电子显微镜(TEM)图片和高分辨透射电子显微镜[0021]图4为本发明所述荧光碳点的X-ray衍射光谱(XRD)。[0022]图5为本发明所述荧光碳点的粒径分布图。[0023]图6为本发明所述荧光碳点的紫外-可见光吸收光谱图。5[0024]图7为本发明所述荧光碳点的荧光光谱图。[0025]图8为本发明所述荧光碳点的傅里叶红外光谱图。[0026]图9为本发明所述荧光碳点的核磁氢谱图。[0027]图10为本发明所述荧光碳点的ICP-MS质谱图。[0028]图11为本发明所述荧光碳点在经660nm激光照射后，产生0₂并导致0₂捕获试剂[0029]图12为本发明所述纳米碳点在细胞内与内质网、溶酶体、细胞膜、线粒体的荧光共定位图。本发明所述纳米碳点与血红细胞孵育后检测探针的溶血性能。内质网的共定位图。[0031]图14为本发明所述荧光碳点在细胞内与内质网、溶酶体、细胞膜、线粒体的荧光共定位图。[0032]图15为本发明所述荧光纳米碳点在细胞内产生ROS的验证。[0033]图16为本发明所述荧光纳米碳点的细胞治疗治疗效果统计图。具体实施方式[0034]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。[0035]本发明一种基于核糖体亲和用于肿瘤光动力治疗的纳米碳点，使用左氧氟沙星、甲苯胺蓝和聚乙烯亚胺作为原料，通过微波法或水热法合成了具有红色荧光和光动力治疗效果的碳点；所述左氧氟沙星可修饰至碳点表面，用于结合定位于糙面内质网的核糖体；所述甲苯胺蓝作为光敏剂在碳点合成中作为碳核，有助于碳点的形成，部分甲苯胺蓝分布于碳点表面，可提供光动力治疗效果，且其具有共轭结构，赋予碳点良好的荧光特性；所述聚乙烯亚胺作为阳离子聚合物，使得碳点表面带有合适的正电荷，有助于细胞对碳点的快速摄取。[0036]本发明纳米碳点的靶向位点特定于细胞内的糙面内质网上的核糖体，从而在细胞内靶向核糖体并在内质网附件进行光动力治疗。[0037]本发明提供基于核糖体亲和用于肿瘤光动力治疗的纳米碳点，并对其合成步骤进行探索。所述碳点简称为LT-CD,其合成步骤如图1所示。[0038]本发明利用左氧氟沙星对核糖体的亲和能力，实现以核糖体上核糖核酸作为靶点的核糖体亲和策略。碳点表面修饰有左氧氟沙星用于结合核糖体RNA,进而将碳点锚定至核糖体，实现精准的荧光成像和靶向治疗。[0039]本发明基于核糖体亲和用于肿瘤光动力治疗的纳米碳点的制备方法，包括以下步(1)通过预先使用盐酸水溶液溶解左氧氟沙星，搅拌直至溶液透明，称为溶液A;(2)将甲苯胺蓝水溶液和聚乙烯亚胺水溶液添加至上述溶液A中，充分混匀，随后CN120204415A说明书4/5页6[0040](3)将步骤(2)中的溶液B放置于家用微波炉中加热，取出并冷却至室温后，加入大量的超纯水并超声分散。[0041](4)在步骤(3)中的水溶液通过水系过滤器滤除不溶物质并保留过滤液。最后，使[0042]本发明所述核糖体纳米碳点的紫外吸收峰分别位于280nm、600nm和660nm。[0043]本发明所述核糖体纳米碳点在580nm的激发光照射下，发出的荧光主峰位于690[0044]本发明基于核糖体亲和用于肿瘤光动力治疗的荧光纳米碳点在660nm激光照射[0045]本发明基于核糖体亲和用于肿瘤光动力治疗的荧光纳米碳点在激发光照射后可发出红色荧光，从而对细胞内进行示踪，用于细胞内成像的应用。[0046]一些实施例中，本发明所述核糖体纳米碳点的粒径范围为1nm-10nm。[0047]一些实施例中，本发明所述核糖体纳米碳点的表面电势范围为20mV-40mV。[0048]本发明的原理为：其一，所述左氧氟沙星可修饰至碳点表面，用于其二，所述甲苯胺蓝作为光敏剂，在碳点合成中作为碳核，有助于碳点的形成，赋予碳点光动力治疗效果，且其具有共轭结构，赋予碳点良好的荧光特性；其三，所述聚乙烯亚胺作为阳离子聚合物，使得碳点表面带有合适的正电荷，有助于细胞对碳点的快速摄取。[0049]如图2所示本发明实施例提供了一种基于核糖体亲和用于肿瘤光动力治疗的纳米碳点在细胞内结合核糖体并靶向内质网的流程图。主要分为两个阶段。首先，LT-CDs在细胞质基质中与核糖体结合，随后与核糖体一同靶向至内质网。并由于LT-CDs具有产生活性氧的能力，因此可在内质网膜上进行光动力治疗。[0050]实施例1本发明基于核糖体亲和用于肿瘤光动力治疗的纳米碳点的制备方法，包括以下步步骤一：通过预先使用10mL的5%盐酸水溶液溶解左氧氟沙星0.5g,在50℃下搅步骤二：将10mL甲苯胺蓝水溶液和5mL聚乙烯亚胺水溶液添加至上述溶液A中，充分混匀，随后转移至50mL圆底烧瓶中，称为溶液B;左质量比已进行优化，优化后的质量比为2:10:1;步骤三：将步骤二中的溶液B放置于家用微波炉中，微波炉功率达到700W,加热时间为5min,取出并冷却至室温后，加入大量的超纯水并超声分散；步骤四：在步骤三中的水溶液通过0.22μm的水系过滤器滤除不溶物质并保留过滤液。最后，使用分子量为3500MWCO的透析膜进行透析一周。并冻干获得最终碳点，称为[0051]如图3所示为本发明所述荧光碳点透射电子显微镜(TEM)图片和高分辨透射电子[0052]如图4所示为本发明所述荧光碳点的X-ray衍射光谱(XRD)。在约25.5的20角度中7[0053]如图5所示为本发明所述荧光碳点的粒径分布图。多数碳点的水合粒径在1.5nm-[0054]如图6所示为本发明所述荧光碳点的紫外-可见光吸收光谱图。碳点LT-CD具有明显的甲苯胺蓝和左氧氟沙星的吸收峰。表明左氧氟沙星已修饰至碳点表面。[0055]如图7所示为本发明所述荧光碳点的荧光光谱图。碳点LT-CD在以580nm作为激发光光源时，具有最强的荧光。且荧光发射位于690nm,有助于避免成像时的荧光干扰。[0056]如图8所示为本发明所述荧光碳点的傅里叶红外光谱图。光谱中具有典型的-CO-NH-红外峰，这归结于甲苯胺蓝带有-NH₂,其在碳化过程中，一部分-NH₂位于碳点表面，且与左氧氟沙星的-COOH偶联形成-CO-NH-。从而使得左氧氟沙星偶联至碳点表面。[0057]如图9所示为本发明所述荧光碳点的核磁氢谱图。核磁氢谱中显示了碳点表面左氧氟沙星存在化学位移，进一步证明左氧氟沙星并未碳化，而是保留于碳点的表面。[0058]如图10所示为本发明所述荧光碳点的ICP-MS质谱图；质谱图可以看出在330.34和348.35处均为左氧氟沙星碎片的m/z的位置，进一步证明左氧氟沙星已修饰至碳点表面。[0059]如图11所示为本发明所述荧光碳点在经660nm激光照射后，产生¹0₂并导致0₂捕获试剂DPBF在420nm处的吸收显著降低，证明了碳点可有效产生0₂。[0060]如图12所示为本发明所述荧光碳点与血红细胞孵育不同时间后的红细胞溶血统[0061]如图13所示为本发明所述纳米碳点在不同细胞中(Hela、SKBR-3、MDA-MB-231、BT549)与内质网的共定位图。表明碳点无细胞特异性，在不同细胞中均具有优良的内质网示踪效果。[0062]图14为本发明所述荧光碳点在细胞内与内质网、溶酶体、细胞膜、线粒体的荧光共定位图。由于核糖体位于糙面内质网，在结果中与内质网的共定位表明了碳点已成功结合至核糖体。荧光碳点在细胞内与细胞膜、线粒体和溶酶体均无共定位效果，证明碳点可避免与其他细胞器的非特异性结合。[0063]图15为本发明所述荧光纳米碳点在细胞内产生ROS的验证。使用DCFH-DA用于[0064]图16为本发明所述荧光纳米碳点的细胞治疗治疗效果统计图。LT-CDs与细胞孵明显降低。[0065]本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范