绵羊和山羊肉产地及地理标志真实性判别方法

在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。DBXX/TXXXX—XXXX本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由内蒙古农业大学提出。本文件由内蒙古自治区肉制品标准化技术委员会归口。本文件起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古自治区质量和标准化研究院、中国农业科学院、内蒙古伊利实业集团股份有限公司。本文件主要起草人：郭军、白扬、朱晓春、赵燕、刘美玲、吴晓莉、唐烁、苏贞、赵志明、睦其尔、王越男、闫鑫磊。DBXX/TXXXX—XXXX1绵羊和山羊肉产地及地理标志真实性判别方法本文件规定了利用矿物质指纹、脂肪酸指纹、稳定同位素比值及指纹组合法建立模型判别绵羊和山羊肉产地及地理标志真实性的方法。本文件适用于判别绵羊和山羊肉产地及地理标志的真实性。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB5009.13食品安全国家标准食品中铜的测定GB5009.14食品安全国家标准食品中锌的测定GB5009.90食品安全国家标准食品中铁的测定GB5009.91食品安全国家标准食品中钾、钠的测定GB5009.92食品安全国家标准食品中钙的测定GB5009.168食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定GB5009.241食品安全国家标准食品中镁的测定GB5009.242食品安全国家标准食品中锰的测定GB5009.268食品安全国家标准食品中多元素的测定GB/T44584地理标志基础术语DB15/T975畜产品牛羊肉中碳、氮同位素丰度比检测方法食品法典委员会.食品完整性与食品真实性问题讨论文件（CX/FICS18/24/7）[S].CodexCommitteeonFoodImportandExportInspectionandCertificationSystems.DiscussionPaperonFoodIntegrityandFoodAuthenticity(CX/FICS18/24/7).欧洲标准化委员会.饲料与食品链中真实性与欺诈——概念、术语和定义（CWA17369:2019）[S].EuropeanCommitteeforStandardization.AuthenticityandFraudintheFeedandFoodChain—Concepts,TermsandDefinitions(CWA17369:2019).3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1产地来源Geographicalorigin指产品或原材料的出产地。本标准指绵羊和山羊生长繁殖和育成出栏地域，具有一定独特自然地理和气候条件、相对独特的牧草种群、饲养模式及水质元素等特性的地域，包括区内外、国内外、牧区和农区、核心和非核心产地等广域或模糊产地划分。DBXX/TXXXX—XXXX23.2地理标志产品geographicalindicationproducts遵守GB/T44584-2024中3.1规定的产自特定地域,所具有的质量、声誉或者其他特性本质上取决于该产地的自然因素、人文因素的产品。本标准指来自特定地域的并获得地理标志认证的绵羊和山羊肉。3.3食品真实性foodauthenticity指农畜产品或食品在营养品质上真实，在自然属性、来源、认证和声称等方面无可争议，即符合所有应该有的特征和属性。是继食品质量、食品安全之后食品的第三种属性要求。本标准旨在判别绵羊和山羊肉产地来源和地理标志的真实性，两者在判别溯源的原理和方法学上本质相同。3.4食品指纹foodfingerprinting指食品的一组或多组与表征或分类相关的化学成分、理化指标或物性指标数据集，以及现代仪器谱图数据集，即数据串，多维向量，一类食品的指纹数据表即构成了数据矩阵。如一组脂肪酸、矿物质和稳定同位素等化学成分；气味、色度和质构等物性指标；光谱、色谱、质谱、超声波和核磁等仪器谱图数据。3.5判别模型discriminativemodel指纹数据的前处理模块、分类和判别分析模块、参数及结果输出和可视化等模块的组合。4原理和技术路线不同产地绵羊和山羊肉的矿物质、脂肪酸和稳定同位素比值等指纹数据具有相对独特的结构模式。用已知产地来源或已获得地理标志认证的绵羊或山羊肉样本指纹数据建立多变量数学模型，对样本进行聚类或指纹数据模式匹配，利用聚类距离或模式相似度判别未知样本的产地来源或地理标志真实性，并输出结果参数和可视化结果。基本内核为多维（多变量）数据数学建模，涉及向量和矩阵运算；聚类(分类）分析、模式分析和判别分析。具体过程见技术路线和建模步骤。DBXX/TXXXX—XXXX3图1建模流程图5材料与方法5.1样本采集充分系统地采集本产地或地理标志认证背景信息清晰的绵羊或山羊肉代表性样本建立总样本（品）集，样本集划分为训练样本集（训练集）和验证样本集（验证集），前者用于模型的建立，后者用于模型的验证和优化。指纹数据采集全面的代表性样本，应作为标准参照样本长期保存，可用于实验室间数据校对、与重要被检（被鉴定样本）同步测定进行指纹测定以及新指纹开发应用。5.1.1采集原则a)采集部位：肌肉样本宜采集背最长肌和或股二头肌，适合矿物质、肌间脂肪酸和稳定同位素指纹测定；皮下脂肪样本，宜采集肋部或腹部皮下脂肪或肥尾脂肪（绵羊适用于用皮下脂肪酸指纹建模。不同部位间（背最长肌与股二头肌，肌间脂肪酸与皮下脂肪酸）指纹模式有所差异，但不影响产地及地理标志真实性的判别。b)代表性原则：样本应具有代表性，覆盖羊肉地理来源总体的各类区域性差异与变异，确保样本集能够充分体现不同产地的特征。应包括来自不同省份、盟市或县域的样本，涵盖典型草原类型（如温带草原、高寒草原、荒漠草原等）、不同生态地带（如农牧交错区、牧区、山区）、以及不同地理气候条件（如干旱、半干旱、湿润地区）等样本，同时考虑屠宰或采样季节、运输与贮藏条件等可能影响产地判别准确性的相关因素，确保模型的普适性与稳健性。c)样本量和数据库：原则上建模样本量越多越好，覆盖上条中的各类代表性样本，各类样本量尽量均匀，各类样本量应至少采集5只代表性羊个体的样本。宜建立区域性羊肉产地指纹数据库，用于本地区域内羊肉来源识别与溯源监管，为地理标志保护、市场抽检与溯源监管等提供技术支撑。d)样本保藏：新鲜羊肉样本宜密闭包装，无马上进行指纹数据检测的样本，尽快冷冻送回实验室，在-18℃以下保藏。5.1.2样本制备DBXX/TXXXX—XXXX4a)方法一：新鲜或冷冻复苏后的样本去除筋膜，切块后用绞肉机搅碎或用组织匀胶机破碎成肉泥，迅速装入样品瓶或样品管中，-18℃以下冷冻保藏。b)方法二：冷冻运回或冷冻保藏的样本，在冷冻状态下切成约1cm3大小的肉丁，加液氮迅速搅拌使之冷冻得更硬，用小型粉碎机粉碎，迅速装入样品瓶或样品管中，-18℃以下冷冻保藏。c)长期保存样本宜充氮密闭保藏，且每个样本宜保藏多份，供复测，仪器方法更新时再测，以及与未知样本直接平行测定等用途。d)冷冻样本从冷冻条件取出后放入4℃冰柜缓慢复苏，在取出放置平衡到室温，擦干样品瓶或管外的冷凝水，称取适量样本，按5.2.1~5.2.3指纹数据检测采集方法的要求进行处理和检测。5.2指纹数据和数据库绵羊或山羊肉总样本集脂肪酸、稳定同位素或矿物质指纹数据按相应的国家标准规范的方法测定，经过数据检验和整理，建立总样本集指纹数据表（库）。数据库建立需进行充分的数据质量检验、初步探索数据结构及分布规律等，重测异常值或异常样本指纹数据，补充缺失值，剔除异常样本等。参见附录表A.1，表头包括检测编号（非必需）、样本编号、物种、产地来源和饲养模式等分类变量（classvariables），即应变量：C1、C2、~、Ci，以及矿物质、脂肪酸、稳定同位素等3类指纹多变量数据，即自变量：X1、X2、~、Xm。各级政府农畜产品和食品监管部门、分析测试服务机构、食品真实性认证机构、行业和企业，宜建立本地域、本行业、本企业羊肉产地来源真实性指纹数据库，根据实验室检测仪器等条件，建立矿物质、和或脂肪酸、和或稳定同位素指纹数据库，有条件3种指纹库都建立，或引用数据服务提供者数据库。产地来源信息未知、待判别的羊肉样本，可与总样本集同步或单独检测其指纹特征，根据建模软件的数据格式要求，纳入总数据库或单独建立数据文件，再加载模型进行产地来源判别。5.2.1矿物质指纹测定应符合GB5009.13、GB5009.14、GB5009.90、GB5009.91、GB5009.241和GB5009.268的规定。根据检测条件和能力，应检测14种以上人和哺乳动物必需、非必需及有害矿物质元素，建议优先覆盖具有地理来源相关性或区域特异性的元素，如与土壤背景、气候、地质成分密切相关的矿物质。宜结合本地地理、生态和生产环境特征，筛选出有助于提升产地判别准确性与模型稳健性的关键矿物质指标。5.2.2脂肪酸指纹测定应符合GB5009.168的规定。按37种脂肪酸甲酯鉴定脂肪酸种类，内标法定量。脂肪酸总量的百分比值（g/100g总脂肪或总脂肪酸）和绝对含量（g/100g肉样）均可建模。前者不受肥瘦及水分和蛋白含量等影响，因此建模更稳健。N稳定同位素测定应符合DB15/T975的规定。δl3C是样品中l3C/l2C的相对比值与国际标准（通常是VPDB）相比的偏差，单位为‰（千分比）。公式：δl5N是样品中l5N/l⁴N的相对比值与国际标准（通常是空气中的N2）相比的偏差。公式：DBXX/TXXXX—XXXX55.3模型建立5.3.1基本原则a)绵羊和山羊宜分别建立产地来源指纹数据库和判别模型。如拟构建绵羊与山羊通用的产地判别模型，需同时具备物种判别功能，以避免不同物种间差异干扰产地判别准确性。b)脂肪酸与矿物质可分别独立建模，可各自筛选具有良好判别能力的关键指纹变量。进一步可联合稳定同位素(δ13C和δ15N）数据，构建更稳健的多源融合指纹组合模型，以提升产地判别的准确性和模型的迁移能力。c)总样本集应持续扩充各产地代表性样本并采集其指纹数据，逐步建立和完善本地区域的羊肉产地指纹数据库，以支撑地理标志保护、市场抽检和追溯监管等多种应用场景。5.3.2模型建立参阅正文图1技术路线图。a)总样本集和样本集划分。系统采集绵羊或山羊肉样本，建立总样本集，并划分为训练样本集（训练集）和验证样本集（验证集）分别用于模型建立和模型验证优化。通常根据样本量大小，从总样本集随机抽取80%~97%样本划分为训练集，20%~3%划分为验证集，进行20~200轮次划分和模型的循环验证优化。如手工完成，通常进行20~50轮优化，一些软件可自动完成，通常进行200轮次的划分和循环验证，并输出验证效果参数和可视化结果。样本集的划分是建模软件操作层面的，通常在建成数据库的过程中或之后，进行数据探索和或正式分析建模时进行。b)指纹数据采集和数据库建立。按5.2所述方法检测采集1~3类指纹指标数据，进行数据检验和数据整理后建立总样本集指纹数据表（库）。c)数据探索和预处理。用数学建模软件打开（读入）总样本集数据库excel文件，也可用粘贴的方式输入，保存建立建模软件的数据库文件并进行数据探索和预分析。通常包括数据模式和分布规律观察、数据变换/转换、数据降维或升维、指纹数据变量取舍或合并、参数设置等、建模方法尝试等必要的旨在获得准确和稳健模型的数据预处理和演算操作，从而确定数据预处理和建模演算方法及参数。数据转换：旨在取消量纲和数量级差异从而平衡变量权重，削弱异常值或异常样本对模型判别稳健性的影响。脂肪酸指纹数据建模，宜采用自尺度标准化（autoscale单位方差标准化（Unitvariancescaling，UV）、帕雷托缩放（Paretoscaling）、均值中心化（meancenter）等方法；稳定同位素和矿物质指纹数据存在单位和数量级差异和较大差距，宜用Log10、autoscale和UV等方法消除量纲和数量级差异。数据降维：数据降维是将m个多维变量抽取共性，压缩到适合建模的少数新变量中。建模通常选择3~10个压缩降维的新建变量，数据可视化通常只选择前三个新变量（如PCA中的主成分/主因子1~3）。数据升维是将少数向量数据变量，拆解变成多个维度变量，旨在加强模型区分能力，如二维聚类重叠不能区分的情况，上升到三维空间区分多一个角度观察，从而区分不同类别，如支持向量机（SMV）变量数据升维。指纹选择和组合：根据载荷向量图（loadingplot）、变量建模能力（modelingpower）或变量重要性VIP图（variableimportance）等分析，选择对区分和判别贡献大的指纹指标数据（变量）建模。或组合不同类别的指纹数据建模，使模型判别能力更强和更稳健，如矿物质与稳定同位素组合。d)模型建立和验证优化。经过充分的数据探索、预分析和反复调试，确定一种或一组数据前处理、建模演算方法和参数，与建模数据库一并保持，即建成初步或某一轮的尝试性判别模型。根据模型拟合参数和内部验证准确率和模型可视化效果图等初步判断模型优劣；打开模型读入验证集指纹数据或文件，DBXX/TXXXX—XXXX6运行判别，模型输出判别结果、相关参数和可视化效果图等。根据验证集的已知类别比较评价模型的判别准确率和稳健性，即模型的外部验证。经过样本集的20~200轮随机划分和数据预处理和分析调试，逐步优化最后确定最佳数据预处理、建模演算方法和参数，与数据库一并保存为判别模型，即建成可实用的判别模型。具体按5.3.2a)进行总样本集的多轮划分，尝试多种数据预处理、建模演算方法、不同参数、指纹指纹变量的取舍和组合，对模型进行反复验证评价，不断优化模型，提高判别准确率和稳健性。模型的外部验证通常需要进行20轮~200轮的循环优化，可手工完成，通常进行20~50轮优化，一些数学建模软件可设置训练集或验证集划分比例及循环验证优化次数，自动完成建模和验证，并输出模型拟合效果参数及可视化效果图。模型参数：如训练集和验证集划分比例、模型95%和99%判别域等。建模方法：通常采样软独立建模类比分类（SIMCA）、最小二乘判别分析（PLS-DA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）、层聚类分析（HCA）和支持向量机（SVM）等。HCA主要靠指纹数据模式相似度判别归类，其他方法主要根据聚类距离判别归类。e)模型应用。将产地来源未知的羊肉指纹数据输入已建立的实用判别模型，运行判别程序，输出其所属地理来源类别，结果为若干设定的目标产地，如“内蒙古某地”“宁夏某地”“陕西某地”等。如输入样本的指纹特征未能显著归属某一已知产地类别，模型可输出“其他类”或“待定”结果，提示可能为未建库地区、边缘过渡带样本，或指纹特征异于当前模型训练集。为提升模型的适用性与容错性，可适当放宽模型判别域参数，使生态环境相近、地理接壤或样本特征交叠区域的样本仍可归入相近产地类别。若需将特定生态类型或地理亚区（如农牧交错带、荒漠草原边缘等）单独设为独立类别，建模时应纳入足够代表性的该类样本。5.3.3建模软件使用任何具备多变量数据解析建模功能的化学计量学、组学和机器学习等领域可进行聚类分析、分类分析、模式分析和判别分析的软件，并具备本标准提及的所有数据预处理和演算方法模块，和或输入输出逻辑路线。可用R语言或Python等开放软件平台自行编程，也可用现成商业开发软件，如SIMCA14.0及以上版本（瑞典SartoriusStedimDataAnalyticsAB公司）、Pirouette4.0及以上版本（美国Infometrix公司）和UnscramblerX10X系列（挪威CAMOSoftware公司）等。5.3.4指纹模型示例附录A.1指纹数据表/库样式。附录B.1绵羊肉矿物质指纹OPLS-DA示例图。附录B.2绵羊肉矿物质指纹OPLS-DA模型验证示例。附录B.3山羊肉矿物质指纹OPLS-DA示例图。附录B.4山羊肉矿物质指纹OPLS-DA模型验证示例。附录C.1绵羊肉脂肪酸指纹PCA示例图。附录C.2山羊肉脂肪酸指纹PCA和OPLS-DA示例图。附录C.3六个产地绵羊背最长肌脂肪酸指纹HCA示例图。附录C.4六个产地绵羊背最长肌脂肪酸指纹HCA模式相似度示例表。附录C.5三个产地山羊背最长肌脂肪酸指纹HCA示例图。附录C.6三个产地山羊背最长肌脂肪酸指纹HCA模式相似度示例表。附录D.1羊肉稳定同位素比值结合矿物质指纹PCA示例图。附录D.2羊肉稳定同位素比值结合矿物质指纹SIMCA判别模型验证示例。DBXX/TXXXX—XXXX7（资料性）指纹数据表(库)样式示例指纹数据库局部示例见表A.1。表A.1羊肉指纹数据表（库）示例X1X2X3112131…2…2…2n2模软件识别汉字，分类变量不需要赋编号），仅对产地建模，其他分类用于观察对产地判别的影响。X，X~X为脂肪放牧与舍饲，其他为样本集纳入的各种可能影响主要分类的变异；指纹指标数据，即自变量，多变量数据，如矿物质、DBXX/TXXXX—XXXX1示例图B.1绵羊肉矿物质指纹OPLS-DA示例图绵羊肉矿物质指纹OPLS-DA示例图见B.1。a.八个盟市得分图b.八个盟市根向量图c.四个盟市得分图d.四个盟市根向量图e.四个盟市得分图f.四个盟市根向量图DBXX/TXXXX—XXXX2图B.1绵羊肉矿物质指纹OPLS-DA示例图B.2绵羊肉矿物质指纹模型验证示例绵羊肉矿物质指纹模型验证示例见表B.2。表B.2绵羊肉矿物质指纹OPLS-DA模型验证示例表99B.3山羊肉矿物质指纹OPLS-DA示例图山羊肉矿物质指纹OPLS-DA示例图见B.3。a.四个旗县得分图