（正式版）DB15∕T 3401-2024 《奶绵羊胚胎冷冻解冻技术规程》

152024-04-15发布本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定本文件归口单位：内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC1I奶绵羊胚胎冷冻解冻技术规程又称诱发结晶，是指在略低于溶液冰点的温度下通过加将处于冷冻状态的胚胎进行解冻处理，以恢复胚胎发育能力的过程。12冷冻液Ⅱ:含10%(v/v)甘油的保存液。冷冻液Ⅲ:含6%(v/v)甘油的保存液。冷冻液IV:含3%(v/v)甘油的保存液。温度在20℃~25℃之间，操作前使用紫外灯消毒20min～30min,胚胎操作区域用75%酒精擦拭根据形态选择发育期为早期桑椹胚(EM)、紧缩桑椹胚(CM)、早期囊胚(EB)、囊胚(BL)和扩张囊胚期(EXB)的A(1)、B(2)级胚胎(附录A图A.2、A.3)进行胚胎冷冻前用保存液洗涤5次～6次；洗涤后的胚胎放入冷冻液I中，室温下平衡15min～20装管方法见附录B,每支装1枚～10枚相同发育期、相同级别胚胎。3胚胎冷冻细管由室温直接置入-6.0℃的程序化冷冻仪中，平衡4min～5min后，在-6.0℃时植冰1s～3s,继续平衡5min,然后以-0.3~-0.5℃/min的速率降温至-35℃,平衡10min,取出胚胚胎冷冻细管由室温直接置入-6.5℃的程序化冷冻仪中，平衡4min～5min后，在-6.5℃时植水浴锅、其余同5.1(体视显微镜、液氮罐、捡胚管、0.22μm细菌滤器、胚胎培养皿)。解冻液I:含0.25mol/L蔗糖的保存液。解冻液Ⅱ:含1mol/L蔗糖的保存液。解冻液Ⅲ:含0.3mol/L蔗糖+3%(v/v)甘油的保存液。解冻液IV:含0.3mol/L蔗糖+6%(v/v)甘油的保存液。解冻时，从液氮罐中取出细管在空气中停留10s～15s后，浸入28℃~32℃水浴中20s,然后将胚胎冷冻细管用灭菌吸水纸擦干，用75%酒精棉球擦拭细管，晾干15s～20s,剪去封口端，把胚胎推出，乙二醇冷冻液冷冻胚胎置入解冻液I中、甘油冷冻液冷冻胚胎置入解冻液Ⅱ中平衡4min~5min,录C表C.2。解冻时，从液氮罐中取出细管在空气中停留10s～15s后，浸入25℃~32℃水浴中20s,然后将胚胎冷冻细管用灭菌吸水纸擦干，用75%酒精棉球擦拭细管，晾干15s～20s,剪去封口端，把胚胎推出后，依次置入解冻液IV、Ⅲ和Ⅱ中平衡4min~5min,然后在保存液中洗5次～6次，镜检备用。同时按NY/T1674执行。解冻后胚胎形态等级信息登记表见附45(资料性)不同发育时期及不同级别胚胎形态图A.1不同发育时期早期胚胎见图A.1。注：a:桑椹胚(morula,M);b:紧缩桑椹胚(compactedmorula,CM);c:早期囊胚(earlyd:囊胚(blastocyst,BL);e:扩张囊胚(expandedblastocyst,EA.2A级胚胎见图A.2。A.3B级胚胎见图A.3。A.4D级胚胎见图A.4。注：a:C级桑椹胚(morula,M);b:D级胚胎(退化胚，不可用)。图A.1D级胚胎6(规范性)胚胎装管示意图见图B.1。胚胎冷冻液胚胎冷冻液II,注：I:1.0cm～1.5