提高慢性乙型肝炎功能性治愈率的新方法和新策略(完整版)

提高慢性乙型肝炎功能性治愈率的新方法和新策略（完整版）【摘要】慢性乙型肝炎（CHB）是由乙型反复炎性病变为主要特征的疾病，可进一步发展为失代偿期肝硬化、肝癌或肝衰竭。目前CHB的抗病毒治疗药物主要是核苷（酸）类似物和干扰素两大类，虽能有效抑制病毒复制，但由于不能破坏共价闭合环状DNA（cccDNA仍面临HBsAg清除率低、停药后易复发等问题，难以实现功能性治愈（或临床治愈）。新型药物及生物制剂的兴起为CHB实现功能性治愈提供新的思路和方向。本文就CHB功能性治愈的新方法及方案作一阐述。【关键词】肝炎，乙型，慢性；肝炎病毒，乙型；功能性治愈；新方法慢性乙型肝炎（CHB）仍是全球性公共卫生疾病，可进一步发展为肝硬化、肝癌或者肝衰竭，故需积极采取措施来降低CHB进展风险[1-2]。而CHB理想的治疗终点是其功能性治愈（临床治愈），即在有限的治疗疗程后，HBsAg、HBVDNA持续不可测，伴或不伴有抗-HBs产生，随着时间推移，肝脏组织病变改善，肝癌发生率减低（不同层次的功能性治愈包括完全阻断cccDNA转录、消除cccDNA、完全解决肝损伤和消除肝癌的水平，但HBsAg清除率只有3%～11%，且停药后易复发。而IFN疗程有限，且不良反应多，HBsAg清除率仅达10%[5]。因此，CHB的功能性治愈仍是个严峻的挑战。鉴于NAs及IFN单一治疗治愈率较低，抗病毒联合免疫调节治疗已—抗病毒/免疫调节治疗提高HBsAg阴转率新方案的研究显示，治疗48周后，IFN联合NAs、集落刺激因子及乙型肝炎疫苗治疗的CHB初治患者HBsAg阴转率达10.0%[6]，而NAs经治的CHB患者HBsA高达15.83%，明显高于单一IFN或IFN联合NAs治疗。本文将对CHB治疗的新方案，包括针对直接抗HBV新靶点相关药物以及调节患者免疫状态相关生物制剂作一概述。一、直接抗病毒治疗1.HBV入胞抑制剂HBV进入肝细胞是HBV与宿主相互作用的第一步，由包膜蛋白介导，而前-S1结构域是受体结合的关键部位。李文辉团队在研究中发现钠-牛磺胆酸盐共转运多肽（Na+/taurocholatecotransportingpolypeptide,NTCP）是HBV感染肝细胞的功能性受体，能够与前-S1区受体结合点特理想靶点，而靶向NTCP药物被称为HBV入胞抑制剂。因此，HBV入胞抑制剂可能阻止非感染肝细胞中的cccDNA从头合成，在预防母婴传播或肝移植后再感染方面可能比清除慢性HBV感染者体内的HBV更有效[3]。MyrcludexB是不可逆NTCP阻滞剂，已被证明能有效防止HBV在体内下降超过1lgIU/mL，明显高于其他治疗剂量组，且有55%实现氨酶（ALT）复常，但HBsAg的血清学水平没有明显改善[9]。尽管NTCP阻滞剂对于已存在的感染效果欠佳，但联合NAs、IFN或者其他制剂可能2.靶向cccDNA治疗清除cccDNA是CHB治疗的中心障碍，新的cccDNA合成可以被治疗可以清除、降解cccDNA或使cccDNA功能表达受阻，然而该领域的努力仍处于初级阶段。2.1嵌合核酸内切酶研究发现，在核酸内切酶上添加一个能与cccDNA序列特异性结合的DNA锚链多肽，可形成嵌合核酸内切酶，能在不影响宿主细胞DNA的前提下靶向识别并剪切cccDNA上的碱基序列。目前研究最多的是锌指蛋白介导的短回文重复序列（theRNA-guiinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR）以及CRISPR相关蛋白（CRISPRassociatedprotins,Cas）核酸内切酶[10以与HBVDNA互补，从而破坏复制。Cradick等[11]在研究中首次证明ZFNs可以在病毒复制的细胞培养模型中破坏36%的质粒衍生的病毒序列。随后Weber等[12]利用腺病毒载体转导表达HBV特异性ZFNs，并在细胞模型中检测其活性，结果发现ZFNs能有效抑制HBVDNA复制。另一种核酸内切酶TALENs利用可识别HBV特异位点的DNA结合域将移码突变引入HBV基因，从而抑制HBVDNA复制。Bloom等[13]报道TALENs可靶向识别S或C开放阅读框，导致35%的cccDNA分子突变。而特异性破坏HBVcccDNA[16-18]。Kennedy等[19]在体外试验中发现CRISPR/Cas核酸内切酶能使肝细胞内的HBVDNA降至1/1000，而肝细胞核内的cccDNA降至1/10。虽然临床前研究显示嵌合核酸内切酶能有效降解cccDNA，但其具体疗效需进一步深入探讨研究。制剂Cai等[20]通过研究筛选出两种磺胺类衍生物，即CCC-0975以及CCC-0346，可抑制rcDNA向cccDNA转化，而且可以针对cccDNA控制表观遗传，同时证明CCC-0975可降低HBV感染的鸭原代肝细胞中的cccDNA合成。然而上述药物均在早期研究阶段，具体疗效尚需更多体外及体内试验进一步评估。RNAi可以直接高度特异性地靶向HBVmRNA转录，明显减少包括HBsAg在内的病毒蛋白的产生。ARC-520由两个合成的短干扰RNAs与胆固醇组成，靶向HBVRNA保守序列从而降低HBVDNA及病毒蛋白水平[21]。Wooddell等[22]在临床试验中让长期服用恩替卡韦的CHB患者分别接受不同剂量的ARC-520（最高达4mg/kg发现HBeAg阴性队列中接受4mg/kg剂量的患者HBsAg下降明显高于其他剂量组；而在接受ARC-520相同剂量情况下，HBeAg阳性患者HBsAg下降较HBeAg阴性患者明显，同时在试验中证明ARC-520具有良好的耐受性，无严重的不良反应。Michler等[23]研究显示，表达短发夹RNA的腺病毒载体（ShorthairpinRNA-expressingadeno-asociated-virusvector,表达，而用新的腺病毒8载体可获得持久的HBV抑制。N-乙酰半乳糖胺偶联siRNA（N-acetylgalactosamine-coupledsiRNA,GAlNAc-siRNAs）通过肝细胞特异性唾液酸糖蛋白受体干扰基因的表达。研究表明，AAV-shRNA和GAlNAc-siRNAs均能抑制HBV抗原的表达，并发现两者在高病毒载量小鼠模型中能够促进治疗性疫苗诱导特异性CD8+T淋巴细胞的免疫应答作用，引起HBsAg及HBeAg血清学转换，实现功能性治愈。而且，部分小鼠甚至在停药5个月后仍能抑制HBV复制，同时无明显的不良反应[24-25]。ARB-1467能够降低HBV所有转录稳定性。Mani等[26]研究表明，AB-452可以降低HBVRNA水平，且对HBV基因型A～H均有效。联合下文将提到的AB-506，以及ARB-1467和NAs能产生明显的协同抗病毒作用。AB-729是在ARB-1467基础上改善而成的一种新型RNA干扰剂，对HBV基因型A～H均有活性，单次皮下注射可抑制病毒复制并减少病毒转录，从而降低HBsAg水平。然而，其效应具有剂量依赖性，且目前具体疗效仍处于临床前研究阶段，需要进一步的数据支持[27]。ARO-HBV可靶向cccDNA及整合DNA产生的所有HBV转录物。研究表明，其在小鼠及食蟹猴属中具有良好的耐受性，每3周剂量可达300mg/kg。单次剂量注射可长久降低高病毒载量小鼠模型中的HBVRNA、HBsAg、HBeAg以及血清HBVDNA水平，且重复皮下注射的疗效较单次剂量更佳，并与恩替卡韦具有协同抗病毒作用。虽然上述药物大多仍在临床前研究阶段，但为CHB治疗提供了新思路，亦启示我们未来CHB治疗可能需要多种药物联合使用[28]。2.4基因沉默DNA的表观遗传修饰可以沉默基因的表达，是宿主防御病毒基因表达的机制。目前已经证实HBx可通过降解染色体的结构维持（Structural转录和病毒复制[18,29]。2.5cccDNA降解editingcatalyticpolypeptide-like,APOBEC）可与HBV核心蛋白相互作用，并转位到核心蛋白上脱氨基后降解细胞核内的cccDNA。最近激动剂可上调APOBEC，从而诱导cccDNA降解，体内与体外试验均表明LTβR可降低HBVDNA水平以及cccDNA浓度，但是其活化持续时间超过1年可能与肝癌的发展有关，因此LTβR激动剂仍需长期治疗相关的临床数据[16]。3.HBV组装过程中相关靶点药物HBV核心/衣壳蛋白/HBc蛋白作为直接抗病毒的靶点近年来得到了广泛关注。目前研究较多的苯基丙酰胺（如AT-61，AT130）、杂芳基二（Pregenomic-RNA,pgRNA）包封或衣壳形成，使逆转录产生无功能的病毒颗粒[31]。新型衣壳蛋白抑制剂NVR3-778在Ia期试验中没有发生治疗或剂量相关的不良反应[16]。Klumpp等[32]在人源化肝脏小鼠中发现NVR-778可降低血清中HBVDNA和RNA水平，并且与聚乙二醇干扰素（PegIFN）的联合使用抗病毒效果更佳。然而其剂量相关的安全性、药代动力学仍在Ib试验期[16]。AB-506作用于核心蛋白二聚体界面，能够导致合成的衣壳缺乏pgRNA，从而阻断rcDNA形成,能有效抑制HBV复制，并可针对HBV的所有基因型。研究表明AB-506在高病毒载量小鼠模型中能降低血清HBVDNA水平，且其效应具有剂量依赖性。在耐受范围内（最高可达100mg/kgAB-506剂量越高，HBVDNA水平下降越明显[26]。EP-027367可通过加速二聚体核心亚基的组装过程，形成基因组缺陷的衣壳，从而有效抑制HBV复制。体外试验显示，EP-027367对稳定表达HBV的细胞株具有抗病毒活性，且对NAs耐药的细胞亦有活性，并与NAs或其他衣壳抑制剂具有协同抗病毒作用。有动物实验表明，而且有着良好的药物耐受性，然而此制剂仍在临床前研究阶段[33]。另一种新型有效的HBV衣壳调节剂GLP-26，在人和狗的血浆、人肝微粒体中均具有良好的稳定性。研究表明GLP-26对抗杂芳基二氢嘧啶突变体T109l有效。体外试验数据证实GLP-26与恩替卡韦具有协同抗病毒作用，能有效降低小鼠模型中HBVDNA、HBeAg以及HBsAg水平[34]。RO7049389是口服的核心蛋白变构调节剂，对HBVA～D基因型均有较高抵抗作用，且与NAs变异体没有交叉抵抗。研究表明，RO7049389与下文将讲述的Toll样受体7（TolllikereceDNA水平，并且在部分小鼠中可出现抗-HBs，目前在临床试验I期[35]。4.新型聚合酶抑制剂长期NAs治疗的局限性在于其耐药性，而新型的NAs可以减少耐药可作为替诺福韦继任者。由于可在淋巴组织和肝脏中积累，因此对于治疗HBV感染具有巨大潜力。相比替诺福韦，TAF具有较低的肾毒性或骨密度是一种新型的鸟苷酸类似物，在细胞内可快速磷酸化，从而抑制HBV复制。然而多中心研究表明，其病毒抑制以及HBeAg血清学转换率与恩替卡韦治疗并没有明显的区别[37]。另外几种包括CMX157、AGX-1009以及MIV-210等制剂现仍处于临床II期试验阶段[16]。尽管这些基于NAs的新型单药疗法对清除HBsAg及cccDNA疗效微乎其微，但联合其他直接抗病毒药物或免疫调节剂可能是未来CHB治疗的主要支柱。5.HBsAg释放抑制剂HBsAg具有抑制免疫系统应答的作用，这可能是慢性持续性HBV感染原因之一，因此HBsAg清除是控制HBV感染的关键环节。理论上，HBsAg释放抑制剂将消除由HBsAg蛋白介导的免疫抑制，并可能产生抗-HBs[38]。REP-2055、REP-2139和REP-2165能够阻断HBsAg释放。Bazinet等[38]在试验中将已经接受26周替诺福韦治疗的40例CHB患者随机分为两组，分别接受替诺福韦+PegIFN+REP-2139或REP-2165两种中的一种和替诺福韦+PegIFN两种抗病毒药物，随访至48周。结果显示前组大多数患者实现HBsAg清除，近半数甚至产生抗-HBs。鉴于上述良好的抗病毒效果，我们需要进一步的大样本数据来支持临床使用。二、抗HBV免疫调节剂免疫系统包括先天性免疫和获得性免疫应答，是抗HBV感染的重要屏障。因此，免疫调节疗法在清除HBV感染细胞中起着关键作用。1.免疫增强剂人类先天性免疫系统通过诸如TLRs的模式识别受体识别病原体，进而引发抗炎反应。HBV可通过下调TLRs完成免疫逃避，故TLRs激动剂可能是诱导免疫应答的新疗法[39]。目前多数研究集中在TLR7的刺激诱导。在成功证明口服TLR7激动剂GS9620可诱导黑猩猩体内HBVDNA的长期抑制，并刺激IFNα的产生后[40-41]，Agarwal等[42]让192例并同时口服替诺福韦48周，在第24周观察疗效。在接受GS9620治疗患者中，只有3例实现HBeAg血清学转换，而HBsAg及HBVDNA水平并没有明显降低，其中少部分患者出现类似于PegIFNα的流感样症状。另一种新型TLR7激动剂RO7020531是双前驱药物，不仅可激活TLR7，亦对TLR8激活有低效能。其安全性高，具有较好的耐受性。小鼠模型研究表明RO7020531可增加生发中心B细胞以及脾脏中HBsAg特异性B床试验I期[35]。2.治疗性疫苗通过疫苗接种诱导有效的免疫应答被认为是控制HBV感染的有效策略。Martin等[43]研究了一种新的可编码HBV核心蛋白、多聚糖酶和胞膜蛋白三个区域的治疗性疫苗TG1050，可诱导小鼠脾细胞和肝内功能性T细胞产生细胞因子，进而抑制病毒复制。GS-474是一种用以表达乙型肝炎特异性抗原的重组热灭活酵母疫苗，其安全性及耐受性较好。临床前小鼠研究表明，GS-474可以刺激迟发性HBV特异性CD8+T淋巴细胞诱慰剂）24周，两组之间的HBVDNA抑制率、HBeAg血清学转换率或肝功能正常化的差异无统计学意义，这可能与宿主的免疫耗竭有关[16]。虽然治疗性疫苗长期以来是CHB一种有前景的治疗方法，但这种策略仍面临挑战。由于病毒抑制与强有力的NAs可能会减少T淋巴细胞衰竭，从而增加治疗性疫苗的有效性，故疫苗联合其他上述制剂可能是未来新的3.T细胞抑制受体增强抗病毒T细胞应答的另一