DB65T 4644-2023 固废纺织原料中大肠埃希氏菌的快速检验方法

固废纺织原料中大肠埃希氏菌的快速检验方法2023-09-20实施2023-09-20实施I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定本文件由乌鲁木齐海关提出。本文件由乌鲁木齐海关归口并组织实施。本文件起草单位：乌鲁木齐海关技术中心、成都海关、新疆师范大学、新疆环疆绿源环保科技有限本文件主要起草人：巴哈提古丽.马那提拜、刘俊、巩志国、王翀、高沙尔.卡依尔哈力、刘冬志、塔伊尔·买买提江、万永亮、王静静、房芳、张伟、车娟、王洁、白梅花、王斌、范伟功、谢伟、张飞宇、刘秀玲。本文件实施应用中的疑问，请咨询乌鲁木齐海关海关技术中心。对本文件的修改意见建议，请反馈至乌鲁木齐海关技术中心(乌鲁木齐市南湖北路116号)、乌鲁木齐海关(乌鲁木齐市北京南路295号)、新疆维吾尔自治区市场监督管理局(乌鲁木齐市新华南路167乌鲁木齐海关技术中心联系电话邮编：830063乌鲁木齐海关联系电话邮编：830011新疆维吾尔自治区市场监督管理局联系电话邮编：830004I目前大多固废纺织原料加工过程中仅靠添加抗菌剂和防腐剂来抑制其携带的微生物的增殖，并不能全面有效杀死其携带的有害微生物，因此固废类纺织原料存在较大的生物安全隐患。常规培养和分离方法费时费力，操作复杂，周期较长。为快速检验固废纺织原料中的大肠埃希氏菌，特制定本文件。1固废纺织原料中大肠埃希氏菌的本文件规定了固废纺织原料中大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)的术语和定义、缩略语、原理、设备和材料、培养基和试剂，描述了检验程序、操作步骤、结果报告的方法。仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本GB4789.6食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测1)dATP:脱氧腺苷三磷酸，deoxyadenosidetripho2)dCTP:脱氧胞苷三磷酸，deoxycytidinet3)dGTP:脱氧鸟苷三磷酸，deoxyguanosidetriphosphate4)dNTP:脱氧核苷三磷酸，deoxyribonucleosidetriphosphate5)dTTP:脱氧胸苷三磷酸，deoxythymidin2利用大肠埃希氏菌发酵乳糖产酸产气、特异性生物酶β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)、分解5溴-4氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷环己基胺盐产生游离5溴-4氯-3-吲哚基的特性，在大肠埃希氏菌发酵乳糖产酸条件下呈蓝绿色的沉淀物，初筛判断大肠埃希氏菌存在可能；编码β-葡萄糖醛酸酶的uidA基因分布于几乎所有大肠埃希氏菌体内，属于大肠埃希氏菌的特异性保守基因，置在电场当中，在一定的电场强度下，不同分子以不同的速度迁移，从而分离出目标DNA片段，与DNA分子量标记物比对，确定样品中是否存在目标菌。除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a)冰箱：2℃~5℃b)恒温水浴箱：44.5℃c)天平：感量为0.1gd)拍击式均质器f)低温高速离心机：转速≥12000r/min,控温4℃~8℃j)无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器1)无菌锥形瓶：容量500mLa)生理盐水：应符合附录A中A.1的要求b)改良EC肉汤：应符合附录A中A.2的要求c)无菌1mol/LNaOH:应符合附录A中A.3的要求g)50×TAE电泳缓冲液：应符合附录A中A.7的要求h)6×上样缓冲液：应符合附录A中A.8的要求j)dNTPs:dATP、dTTP、dGTP、dCTP每种浓度为2.5mmol/L3o)DNA分子量标记物(100bp-p)凝胶染色液浓度(0.5μg/mL)大肠埃希氏菌的定性检验程序见图1检样10检样10g+200mL生理盐水取10mL改良EC肉汤50mL4样品以无菌操作称取检样10g,加入装有200mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器均质取10mL样液加入50mL改良EC肉汤试管(管内有小倒管)中，44.5℃±0.2℃培养24h±2h,观察小倒管内是否产气、产蓝绿色沉淀。24h±2h未产气、不产蓝绿色沉淀的则判定为大肠埃希氏菌阴性；对产气、产蓝绿色沉淀者进行PCR确认实验。9.3PCR确认实验离子水充分混匀菌体，于100℃水浴或者金属浴维持10min;冰浴冷却后，12000r/min离心3min,收模板直接用于PCR反应或暂存于4℃并当天进行PCR反应；否则，应在-20℃以下保存备用(1周)。9.3.2.2阴性对照：非目标菌提取DNA作为PCR反应的模板；9.3.2.3阳性对照：大肠埃希氏菌标准菌株提取DNA作为PCR反应的模板。9.3.3.110×引物工作液配制：引物干粉稀释成100μmol/L储存液后，根据目标基因对应PCR体系内引物终浓度，使用灭菌去离子水配制10×引物工作液。引物在反应体系内的终浓度应符合附录9.3.3.2根据样本数量设定所需要PCR反应管数：1管空白对照+1管阴性对照+1管阳性对照+样本9.3.3.3将10×引物工作液、10×PCR反应缓冲液、离子水从-20℃冰箱中取出，融化并平衡至室温，使用前混匀；5U/μLTaq酶在加样前从-20℃冰箱取出。9.3.3.4PCR反应体系为：总体积25μL,灭菌去离子水12.1μL;10×PCR反应缓冲液2.5μL;预变性94℃10min;变性94℃30s,复性63℃30s,延伸72℃1.5min,30个循环；72℃9.3.5凝胶电泳9.3.5.1琼脂糖凝胶制备应符合下胶孔，小心上样于孔中。阳性对照的PCR反应产物加入至最后一个泳道；第一个泳道中加入2μL5电泳结果中空白对照应无条带出现，在阴性对照未出现条带，阳性对照出现预期大条件下，如待测样品未出现相应大小的扩增条带，则可报告该样品检验结果为阴性；如待测样品出现相应大小扩增条带则可判定该样品结果为阳性。根据发酵实验、PCR确认试验的结果，报告被检样品中检出或未检出大肠埃希氏菌。11.1检测过程中严格分区操作，需符合GB/T27403的要求，以防止核酸的交叉污染。6(规范性)A.1.1成分及含量，见表A.1生理盐水各成分及其含量氯化钠(NaCl)将氯化钠在蒸馏水中溶解，121℃高压灭菌15min。磷酸氢二钾(K2HP04)磷酸二氢钾(KH2P04)氯化钠1mg/mL5溴-4氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷环己基胺盐溶液。A.2.3制法将成分A溶解于蒸馏水中，校正pH至6.9±0.2。分装到有玻璃小倒管的试管中，121℃高压灭菌7A.3.2制法A.4.1成分及含量，见表A.41mol/LHCI盐酸(HC1)A.5.1成分及含量，见表A.5TE子水均匀，再定容至1000mL,121℃A.6.1成分及含量见表A.610×PCR氯化钾(KC1)8将氯化钾溶于1mol/LTris-HC1(pH8.5),定容至1000mL,121℃高压灭菌15min,分装后-20℃保存。A.750×TAE电泳缓冲液A.7.1成分及含量，见表A.750×TAE成分及其含量冰乙酸(CH3COOH)A.7.2制法Tris和EDTA-2Na溶于800mL灭菌去离子水，充分搅拌均匀；加入冰乙酸，充分溶解；用1mol/LA.86×上样缓冲液A.8.1成分及含量，见表A.86×上样缓冲液成分及其含量甘油溴酚蓝A.8.2制法0.5mol/LEDTA(pH8.0)溶于500mL灭菌去离子水中，加入溴酚蓝和二甲苯氰FF溶解，与