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文档简介

2018-1-25发布2018-2-25实施新疆维吾尔自治区质量技术监督局发布I本标准根据GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求编写。本标准由新疆维吾尔自治区畜牧厅提出。本标准由新疆维吾尔自治区畜牧厅归口。本标准由新疆畜牧科学院畜牧研究所和新疆农业大学负责起草。本标准主要起草人：田可川、黄锡霞、赵冰茹、何军敏、吴伟伟、田月珍、王旭光、徐新明、付雪12.2巢式PCR是一种变异的聚合酶链式反应(PCR),使用两对(而非一对)PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。PCR扩增PolymeraseCha合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等反应组成一个周期，循2选取妊娠时期3周～10周的绵羊。每只绵羊颈静脉采血量为3mL~5mL,EDTA或肝素钠(1%)等抗凝，采血后，颠倒混匀防止血液凝固；非抗凝管采血量为3mL~5mL;并于采血后2h内进行血浆b)绵羊SRY基因引物(绵羊SRY基因巢式内外引物利用Primer5.0软件自行设计，交由生物公司合成)a)Eppendorf移液器b)Cycler型PCR仪d)小型离心机e)凝胶成像仪取EDTA抗凝血3mL置于离心管，3000rpm离心15mi3.4.3游离胎儿DNA提取3DB65/T4093—20183.4.4巢式PCR反应及第2轮反应体系优化PCR反应体系20μL:DNA模板(50ng/μL)1.5μL,上、下游引物(10μmol/L)各0.75μL,2×TagPCR反应扩增程序：95℃预变性3min;94℃变性30s,退火30s温度如表1所述，72℃延伸60s,此步骤共计35个循环；72℃延伸5min;4℃保存。经过PCR指数式扩增后，模板浓度会显著增加，所以需要对模板进行第2轮优化，采用1:50倍比稀释进行第2轮PCR扩增。PCR产物用2%琼脂糖凝胶在110V条件下电泳30min检测，染色后用凝胶成像仪拍照，记录结果。表1巢式PCR内外引物序列及相关信息引物名称引物序列(5′→3′)产物大小(bp)复性温度(℃)R:GTATTTGTCTCGGTGTAT3.4.5结果判定通过凝胶电泳结果(图1)进行判定：单条带为SRY检测阴性判定为雌性；两条带为阳性判定为雄性；二者均未出现者为空白对照或游离DNA提取失败样。SRY阳性样品：1,2,4,5,7,9,10,11,13,14胶孔；3.4.6结果表述所检测胎儿的性别为雄性(或雌性)。4参考文献[1]Sambrook,J.andRussell,D.W,著(2002)黄培堂等，译.分子

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