DB65T 4315-2020 棉花品种真实性鉴定 SNP分子标记法

Identificationgenuinenessofcottonvarietyb2021-02-01实施2021-02-01实施新疆维吾尔自治区市场监督管理局发布I本标准按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定本标准由中国农业科学院棉花研究所提出。本标准由新疆维吾尔自治区农业农村厅归口并组织实施。本标准起草单位：中国农业科学院棉花研究所、新疆维吾尔自治区植物保护站、农业农村部农产品质量安全中心、新疆农业科学院、新疆维吾尔自治区种业发展中心。本标准主要起草人：匡猛、温少辉、黄龙雨、魏守军、周大云、吴玉珍、王延琴、艾先涛、聂新辉、梁亚军、宋羽、高翔、辜立新。本标准实施应用中的疑问，请咨询中国农业科学院棉花研究所。对本标准的修改意见建议，请反馈至新疆维吾尔自治区市场监督管理局(乌鲁木齐市新华南路167号)、中国农业科学院棉花研究所(河南省安阳市开发区黄河大道38号)。新疆维吾尔自治区市场监督管理局联系电话传真邮编：830004新疆维吾尔自治区农业农村厅联系电话邮编：830049中国农业科学院棉花研究所联系电话邮编：4550001本标准规定了利用单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphisms,SNP)标记进行棉花凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程扞样针对某一特定品种DNA分子标记鉴定提供的，除核心位点之外的能够将该品种与其它品种区分开27.2.1DNA提取方法应保证提取的DNA数量和质量符合PCR扩增的要求，DNA无降解，溶液的紫试样种子充分研磨后，取(100～200)mg种子粉末置于2.0mL离心管，每管加入700μL的SDS提轻颠倒混匀至絮状DNA成团析出。用剪口枪头吸取DNA,转移至盛有70%乙醇的离心管中洗涤一次，3异丙醇，轻轻颠倒混匀至絮状DNA成团析出。用剪口枪头吸取DNA,转移至盛有70%乙醇的离心管中7.3.1本标准推荐了78个核心SNP位点。SNP位点的染色体位置、等位基因及侧翼序列信息见附录7.3.2检测按照位点的编号顺序进行，当检测差异位点数达到可以78个SNP位点检测完成时，所检测到的差异位点数仍达不到判定待测样品与对照样品不符时，停止检7.4.1SNP位点分型方法主要有KASP标记法和测序法等方法。基于KASP标记技术的分型方法推荐7.4.2基于SNPline平台7.4.2.2PCR体系94℃15min;94℃20s,61℃~55℃60s,10个循环(每个循环降低0.6℃);94℃20s,55℃60s,4DNA质量要求为：>100ng/μL,工作液浓度为20ng/μL;OD260/280值为1.8~2.0,OD260/2301.5~2.0。测试样品中要包含2个参照样品和2个空白对照。引物：按照附录C所提供的SNP位点信息设计合成相应的引物。每个PCR反应体系所使用的DNA总量为40ng,2×KASPMasterMix预混液5μL,KASP引物0.14μL,去离子水3uL,总体积10μL。7.4.3.3PCR扩增程序94℃15min;94℃20s,61℃~55℃60s,10个循环(每个循环降低0.6℃);94℃20s,55℃60s,26个循环。7.4.3.4荧光扫描和数据分析单独运行程序37℃,60sec,1循环后，利用realtimePCR仪自带软件，对样品基因型数据进行读取。8数据记录与统计8.1数据记录数据记录方式为具体基因型，如某个位点为A/G变异，则有AA、AG、GG三种基因型，缺失数据8.2数据统计对成对比较的两个样品的差异位点情况进行统计，计算比较位点数目和差异位点数目。差异位点分为下列四种情形：——位点存在差异的，记录为有差异；——位点完全相同的，记录为无差异；——位点数据缺失的，记录为缺失；——位点显示无法判定的，记录为无法判定。9结果表述比较待测样品和标准样品是否相同，结果表述如下：待测样品XXX与标准样品YYY利用SNP分子标记法，采用检测平台，比较位点数为,差异位点数为,差异位点编号5(资料性)等位基因及侧翼序列TATGAGCATCCTATGAACTATTCGAATGTGTTTCT[G/A]TTTTTCTATTACATGTATGTTTATATGTCAGTTAATTTTGATGCCACTGTTAATGGGACAAAAA[T/C]GTGTTACGATCTCGTAGCCAGAGATCACGATGGTATTACTCGACCTGTTACTCGACCTAGTATTACT[C/TGACCTGTTACTGAGACATTGGGACAAGCAAATTGTACAACTTAACCTAATGAATTTAACAATTA[C/A]CATTTGAAGTTTTGAATTGAATGGAGGGACAGCTAGCACTATTTCGAACAACCATCTCTATGCTTGC[A/C]GcCCCCAGATCACTATAAAAGCCAACATATAGATTTCAGCCACCGAGGACAGCAGACCATGTC[A/G]CCGACAACCAATGGCCGTCGTAGAGGCTCGTCGTCCAACTAATTACAATTTGGCCACTAAAACTTTT[A/G]AATTTGCTGTGGAGTCTGGCCATTTGCTAAAGTGTCCAAGAGTTCAAAAACAACAAAAAAGATTT/G]TTCGATTGAAAGCACGAAGGATTTGGATTCCATTCTCATTTTGAATATGGCGCAATTAGAAGGTTAG[CT]CTTTGAGTTTGTGATGTGAACGTGTGTGTTAAAGCTCAGGCTACCTCTGTGGCTAGTGTTGACA[G/A]CGTGAAGAACAATAAACTGGAATGTCCGTACTATCCAGTCTGTACTGCCAGATTGGGTTAAGGC[T/C]TAACTCTGATCCGTCAACTGCATCTGCTACTCGAGTTTTAATTCGATTTTTTTCATGTTTTCCATTC[A/G]TTTGTGTTATAATAATTTAATTCTAGTTGTTCTCGTACCACCATGAAAAACATTTAAAAAAAAC[T/G]AAACATAAATACGTATGTCGGACATATACAGTGTATTTTATGTAGTCAACACTTATACCGTAAG[A/C]ATTCATATTGAGTTAAGAAGTTGATTCGAAAGTTGGATGGGGGTATTACTTGCAATTTTATGCAAACT/C]CGAGTCGCAAACTTGTTACCAAGGAATGAAGTGTTTCTCAACCACGAAAAGGGTTTCCCAAACT[T/C]TACAAAAAATGGGGGAAGTCAATATGGCAAACGTCGAAGTAAACAATAAATAAAAAAAGTAGCGTGG[T/G]TAGATTATACTTGTACTAGTATTTGGATTCGGAAAAGGCAATGTTGTGGTAGATGCTCTATGTC[G/A]GAGATCAATGACTGATTTACGGGCGATGGCGACACTGTCTTCAAATCCTGGATACTTTGACTT[T/C]GAAGTCTAGTATTGCAATGCCATTCCTCAACAAAAGGCTCCCTATTTCTTCTTATAACTGAAATC/A]AAAAAAATGAAATCCCCCCGAATCTTTTTTTCATACGTCTCTAAAGAGAAACCGCTGTGAGTTTGTG[G/A]GGCATTCGTCAATTGGTCCTATACGTCTCGGATACATCTCCCTATTTGTTTCTAAAATAGATTACT[C/T]ACCAACTGTCGATAGGTAGCTCTTGTATTCTTGATCGGAGAGACCATCGATGCCAAAGGCCTTACGG[A/G]GGTCCATTTGAGCGAAAGCATCCAAAAATCCTTTTAACTACTCTGTAAGGAACAGACATAGACT[T/C]ACCTAGTAGACATTTCATTAACGCACAAATATACATTGATCTTTAAGATAACTTAAACTCTCT[T/G]GGTATTACTCCATAGAATAGATAGACTATCTTTGGGACAATTTCTCAGGTGTCTCGCCATAATCGCT[A/G]ACTTTGTCCCTTCCTTATGTATATTCTTTCTGGTTTTCGAATCTGATTGCGTGGGTTTGATAAA[CT]AGGCTCAATAAAACAAAAGTTGACTTTTTCCCATATCTAAAAGCTTCTTCAATTATTTCCGCA[A/G]CTTTTTTAATTACGATAAAGACATACAATTGTAAACAGATAAAGCTGCTTCCATCCGAGAATGC[G/A]TCCAATACGATTTGCATTCTACCTGTTTCATTGTTTCAGGATAATCATCAATATCACCATCACC[G/A]GTGTCCTCTGTGAAATCATATTCAGCGGAAACGGAAGAACCGGTATTGGACAGATAACATAAGAAGA[G/T]GTGTTCGCTTTGGGGCTCGGCGGCCTTGAGGATGGTCCCATGTCGTTTTCCACTCCTCATGTCT[C/T]GGTGCAGTGGGTTCTAAGATTTGAATTCTTTTGTCAATTCTTACCAATTATACCTTCCTACCAT[G/A]TAAAACACAGACAAAGATACGCTTGGAACTAAACACAGGGCGGTCCGTCGGGACACTAAACTGG[A/G]GTAGTCCTATTGGGAAATATGCCCATATT6等位基因及侧翼序列TTGAAAATTAAAAATTTAGCTCCATTTTTCACACG[A/G]CCTCAGACATACCTGTGTGTATAGGCCGTAGGACCGTACGGTCAGATCTAAGCCGTATTCTAGC[A/G]ATGTCGTTTACCGGTACTCAGCAGAAATGCAATACGGTTAATGGAAGATCTTATTCAGATGGATTCA[C/T]TTTAATGTTTAATTTTTGAGTTGCATGCAACAACATGACGCCAAATACAGGATGAAGAAAAACC[G/A]GGAGAATGAAAGGCTCAAGGAAGAGAATATCAATGGCTTCTGAAGAAGACGACGGCTTTCAAATTGG[T/CJAAAGTTGCAGAGGAAAGCAAATATGAGGTACTAAGATGATGCTCTGAAAGGTTGATGAAGCTAAGAT[CIA]GATGAGAGCAAACAAATGGACTTTGCTAAGCTCTCACATGCTTGCACATGTACAAAAGGTATTTCTT[G/A]TGCCCATTGTTCTTTTTTCAAAATTCAACAATTTTCAATCATCATTCCTCGTCAAATGTCCTCTT/G]TCAATCTTCAACAACAACAGCATTTCAATTATGTGACCAACTACCCCATTATTGGTAGGTACAC[G/A]AGTTGCATGGACCTGAGGCCTAGTCGTCAAGCCAAACGTCAACCACTGAGAGGTGGGACAACTA[A/G]TTGAGCGAGAGTGAATGGATAGCTTGAGGGCTCGGTCCAAGTCAGTATCGCCTCCATGGCGAGCTTC[G/A]CCATCAGAATTCTCAGCATCCTCTTCTTCTTCATGCTGTGTGTAACAGGATACATTTGCTTGT[C/TJGCTGTTGATTTGAGAAATATAACAAAATTGATGGTGCTGTCAAATTATTGAAGCAGTTAATTGG[A/C]GAAAGTA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