DB15∕T 2073-2021 动物垫料中单核细胞增生李斯特氏菌检测

ICS07.100.99

CCSB41

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T2073—2021

动物垫料中单核细胞增生李斯特氏菌检测

DetectionofListeriamonocytogenesinanimalpadding

2021-01-25发布2021-02-25实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T2073—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。

本文件起草单位：中华人民共和国呼和浩特海关、内蒙古农业大学、鄂尔多斯市动物疫病预防控制

中心、内蒙古自治区农牧业科学院。

本文件主要起草人：赵治国、郭晓宇、张晓东、敖威华、王海艳、崔强、陈林军、延涵、靳木子、

李军燕、罗晓平。

I

DB15/T2073—2021

动物垫料中单核细胞增生李斯特氏菌检测

1范围

本文件规定了动物垫料中单核细胞增生李斯特氏菌的分离鉴定定性检测法。

本文件适用于动物垫料中单核细胞增生李斯特氏菌定性检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T33682基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则

SN/T1538.1培养基制法指南第1部分：实验室培养基制法质量保证通则

SN/T1538.2培养基制法指南第2部分：培养基性能测试实用指南

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

动物垫料animalbedding

用于吸收动物排泄物，使动物保持舒适生活环境的铺垫物。

注：包括动物笼内非直接与动物机体接触的铺垫物。

4设备和材料

4.1冰箱：2℃～5℃。

4.2恒温培养箱：30℃±1℃，36℃±1℃。

4.3均质器。

4.4振荡器。

4.5电子天平：感量0.1g，0.0001g。

4.6全自动微生物生化鉴定系统。

4.7飞行时间质谱仪。

4.8二级生物安全柜。

4.9光学显微镜。

4.10pH计。

4.11微量移液器。

1

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4.12无菌锥形瓶：500mL，250mL。

4.13无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

4.14无菌培养皿：15mm×90mm。

4.15无菌试管：18mm×180mm。

4.16无菌量筒：250mL，1000mL。

4.17无菌棉签。

4.18无菌镊子。

4.19无菌剪刀。

4.20无菌勺。

4.21无菌玻片。

4.22无菌接种环。

5培养基和试剂

5.1实验用水：符合GB/T6682的要求。

5.2含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE):见附录A中A.2。

5.3HalfFraser肉汤和Fraser肉汤:见附录A中A.3。

5.4牛津琼脂:见附录A中A.4。

5.5革兰氏染液:见附录A中A.5。

5.6SIM动力培养基:见附录A中A.6。

5.7缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和V-P试验用]:见附录A中A.7。

5.85%~8%羊血琼脂:见附录A中A.8。

5.9糖发酵培养基（木糖和鼠李糖）：见附录A中A.9。

5.10过氧化氢试剂:见附录A中A.10。

5.11无菌生理盐水:见附录A中A.11。

5.12李斯特氏菌显色培养基。

5.13生化鉴定试剂盒。

5.14革兰氏阳性菌生化鉴定卡。

5.15飞行时间质谱仪靶板。

5.16单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株ATCC19111或CMCC54004，或其他等效标准菌株。

6检验程序

单核细胞增生李斯特氏菌检验程序见图1。

2

DB15/T2073—2021

样品制备

检样25g（mL）+225mLHalfFraser肉汤，均质

30℃±1℃,24h±2h

0.1mL培养物匀液+10mLFraser肉汤

30℃±1℃,24h±2h

李斯特氏菌显色平板牛津琼脂平板

36℃±1℃,24h～48h

接种木糖、鼠李糖，36℃±1℃,24h±2h；

并在TSA-YE平板上划线，36℃±1℃,18h±24h

木糖-，鼠李糖+

鉴定

结果报告

图1单核细胞增生李斯特氏菌检验程序

7操作步骤

7.1取样

7.1.1取样原则

应遵循随机性、代表性的原则。取样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。

7.1.2样品处理

7.1.2.1颗粒状或粉末样品

对送检样品包装内不同部位样品进行随机多点取样至少250g，充分混匀后称取25g颗粒状或粉

末状垫料样品，加入225mLHalfFraser肉汤，充分振摇或均质1min～2min，置30℃±1℃培养

3

DB15/T2073—2021

24h±2h预增菌。

7.1.2.2平面样品

无菌操作将灭菌规格板（5cmÍ5cm）放在平面垫料表面，用浸有无菌稀释液（磷酸缓冲液或生理

盐水）的棉拭子，在规格板内来回均匀涂抹整个方格3次，并随之转动棉拭子，然后用灭菌剪刀剪去

棉拭子与手接触的部分，将棉拭子头置入装有25mL无菌稀释液的无菌锥形瓶中，根据样品面积大小

重复取样1～4个规格板面积，相应地将棉拭子头置入25mL～100mL的无菌稀释液中，充分振摇制成

样品原液（1mL原液对应的样品面积为1cm2），取样量见表1。取25mL样品原液加入225mLHalfFraser

肉汤，充分振摇或均质1min～2min，置30℃±1℃培养24h±2h预增菌。

表1不同面积平面类垫料样品取样量

样品面积取样量

规格板数

m2cm2

小于0.25（含）251

0.25～0.5（含）502

0.5～0.75（含）753

大于0.751004

7.2二次增菌

轻轻摇动经过培养的样品混合物，移取0.1mL，转种于10mLFraser肉汤，于30℃±1℃培养

24h±2h。

7.3分离培养

分别蘸取Fraser肉汤二次增菌液，划线接种于李斯特氏菌显色平板和牛津琼脂（OXA）平板，于36℃

±1℃培养24h～48h，观察2种平板上生长的菌落。典型菌落在OXA琼脂平板上为黑色菌落，周围

有一黑色的环，直径1.5mm～2mm；在李斯特氏菌显色平板上的菌落特征，依据产品说明书进行判定。

7.4初筛

从选择性琼脂平板上挑取3～5个典型菌落或可疑菌落，分别接种木糖、鼠李糖发酵管，于36℃±1℃

培养24h±2h，同时在TSA-YE平板上划线，于36℃±1℃培养18h～24h，然后选择木糖阴性、鼠李

糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。

7.5鉴定

7.5.1革兰氏染色镜检

李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌，大小为0.4μm～0.5μm×0.5μm～2.0μm；用生理盐水制成

菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。

7.5.2动力试验

4

DB15/T2073—2021

挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺半固体或SIM动力培养基，于25℃～30℃培养48h±2h，李

斯特氏菌有动力，在半固体或SIM培养基上方呈伞状生长。如伞状生长不明显，可继续培养5d，再

观察结果。

7.5.3溶血试验

用划线接种法或穿刺接种法，将可疑菌落或典型菌落纯培养物接种血琼脂平板，于36℃±1℃培

养24h～48h，在明亮处观察，单核细胞增生李斯特氏菌呈现狭窄、清晰、明亮的β溶血，若结果不明

显，可置4℃冰箱24h～48h再观察。

7.5.4生化试验

挑取纯培养的菌落进行单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性

反应的菌落继续进行糖发酵试验和MR-VP试验。具体操作依据生化鉴定试剂盒说明书进行。单核细胞增

生李斯特氏菌的主要生化特征见表2。

表2单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别

菌种溶血反应葡萄糖麦芽糖MR-VP甘露醇鼠李糖木糖七叶苷

单核细胞增生李斯特氏菌

＋＋＋＋/＋－＋－＋

(L.monocytogenes）

格氏李斯特氏菌

－＋＋＋/＋＋－－＋

(L.grayi)

斯氏李斯特氏菌

＋＋＋＋/＋－－＋＋

(L.seeligeri）

威氏李斯特氏菌

－＋＋＋/＋－V＋＋

(L.welshimeri）

伊氏李斯特氏菌

＋＋＋＋/＋－－＋＋

(L.ivanovii）

英诺克李斯特氏菌

－＋＋＋/＋－V－＋

(L.innocua）

注：＋阳性；－阴性；V结果不定。

7.5.5辅助鉴定

可根据实验室情况，选取纯培养的菌落用全自动微生物生化鉴定系统或飞行时间质谱仪等进行鉴定，

具体操作依据标准GB/T33682和设备操作规范进行。

8结果报告

综合生化鉴定结果、动力试验结果、溶血试验结果和辅助鉴定结果，报告25g（cm2）动物垫料样

品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌。

9生物安全措施

为了保护实验人员安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，孕妇不应从事单核细胞增生李斯特

氏菌的培养和检测工作，所有培养物应小心处置，应按照GB19489的有关规定执行。

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10废弃物处理和防治污染的措施

检测过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30min后再弃置。

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附录A

（规范性）

培养基和试剂

A.1培养基制法及质量保证

按照SN/T1538.1和SN/T1538.2执行，并对制法好的培养基进行性能测试，如使用等效的脱水合成

培养基，使用前对其进行验收并按其说明书使用。

A.2含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)

A.2.1成分

胰胨17.0g

多价胨3.0g

酵母膏6.0g

氯化钠5.0g

磷酸氢二钾2.5g

葡萄糖2.5g

琼脂15.0g

蒸馏水1000mL

A.2.2制法

将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，煮沸溶解，调节pH至7.2±0.2，高压灭菌121℃，15min，倒

板备用。

A.3HalfFraser肉汤和Fraser肉汤

A.3.1基础培养基

A.3.1.1成分

肉胨5.0g

胰化蛋白胨5.0g

牛肉浸膏5.0g

酵母浸膏5.0g

氯化钠20.0g

磷酸氢二钠12.0g

磷酸二氢钾1.35g

七叶苷1.0g

蒸馏水1000mL

A.3.1.2制法

将上述各成分溶于水后加热溶解，调节pH至7.2±0.2，分装后于121℃灭菌15min，备用。

A.3.2氯化锂溶液

A.3.2.1成分

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DB15/T2073—2021

氯化锂3.0g

蒸馏水10mL

A.3.2.2制法

将氯化锂溶解于蒸馏水中，过滤除菌。

A.3.3萘啶酮酸钠盐溶液

A.3.3.1成分

萘啶酮酸钠盐0.1g

0.05M氢氧化钠溶液10mL

A.3.3.2制法

将萘啶酮酸钠盐溶解于氢氧化钠溶液中，过滤除菌。

A.3.4盐酸吖啶黄素溶液

A.3.4.1成分

盐酸吖啶黄素0.25g

蒸馏水100mL

A.3.4.2制法

将盐酸吖啶黄素溶解于蒸馏水中，过滤除菌。

A.3.5柠檬酸铁铵溶液

A.3.5.1成分

柠檬酸铁铵5.0g

蒸馏水100mL

A.3.5.2制法

将柠檬酸铁铵溶解于蒸馏水中，过滤除菌。

A.3.6HalfFraser肉汤

A.3.6.1成分

基础培养基（A.3.1）100mL

氯化锂溶液（A.3.2）1.0mL

萘啶酮酸钠盐溶液（A.3.3）0.1mL

盐酸吖啶黄素溶液（A.3.4）0.5mL

柠檬酸铁铵溶液（A.3.5）1.0mL

A.3.6.2制法

临用前，按照需用量将A.3.2～A.3.5四种溶液加入到A.3.1溶液中。

A.3.7Fraser肉汤

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DB15/T2073—2021

A.3.7.1成分

基础（A.3.1）100mL

氯化锂溶液（A.3.2）1.0mL

萘啶酮酸钠盐溶液（A.3.3）0.2mL

盐酸吖啶黄素溶液（A.3.4）1.0mL

柠檬酸铁铵溶液（A.3.5）1.0mL

A.3.7.2制法

临用前，按照需用量将A.3.2～A.3.5四种溶液加入到A.3.1溶液中，混匀后每试管分装10mL备用。

A.4牛津琼脂（OXA）

A.4.1基础培养基

A.4.1.1成分

哥伦比亚琼脂39.0g

七叶苷1.0g

柠檬酸铁铵0.5g

氯化锂15.0g

蒸馏水1000mL

示胨23.0g

淀粉1.0g

氯化钠5.0g

琼脂（所用的量根据琼脂的凝胶强度来定）9.0g~15.0g

A.4.1.2制法

将上述各成分溶于水后煮沸溶解，调节pH至7.2±0.2，分装后于121℃灭菌15min，备用。

A.4.2用于1000mL培养基的添加剂

A.4.2.1成分

放线菌酮400mg

硫酸粘菌素20mg

吖啶黄素5.0mg

头孢替坦钠2.0mg

磷霉素10mg

乙醇5.0mL

蒸馏水5.0mL

A.4.2.2制法

将上述各成分溶解于乙醇/水溶液中，过滤除菌。

A.5革兰氏染液

A.5.1结晶紫染液

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A.5.1.1成分

结晶紫1.0g

95%乙醇20mL

1%草酸铵水溶液80mL

A.5.1.2制法

将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

A.5.2革兰氏碘液

A.5.2.1成分

碘1.0g

碘化钾2.0g

蒸馏水300mL

A.5.2.2制法

将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。

A.5.3沙黄复染液

A.5.3.1成分

沙黄0.25g

95%乙醇10mL

蒸馏水90mL

A.5.3.2制法

将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。

A.5.4革兰氏染色法

A.5.4.1涂片用火焰固定后滴加结晶紫染液，作用1min，水洗。

A.5.4.2滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。

A.5.4.3滴加95%乙醇脱色，约15s～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。

A.5.4.4滴加复染液，复染30s～1min，水洗、待干、镜检。

A.6SIM动力培养基

A.6.1成分

胰胨20.0g

多价胨6.0g

硫酸铁铵0.2g

硫代硫酸钠0.2g

琼脂3.5g

蒸馏水1000mL

A.6.2制法

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将上述各成分加热混匀，调节pH至7.2±0.2，分装小试管，121℃高压灭菌15min，备用。

A.6.3试验方法

挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺接种到SIM培养基中，于25℃～30℃培养48h，观察结果。

A.7缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和VP试验用)

A.7.1成分

多价胨7.0g

葡萄糖5.0g

磷酸氢二钾5.0g

蒸馏水1000mL

A.7.2制法

溶化后调节pH至7.0±0.2，分装试管，每管1mL，121℃高压灭菌15min，备用。

A.7.3甲基红(MR)试验

A.7.3.1成分

甲基红10mg

95%乙醇30mL

蒸馏水20mL

A.7.3.2制法

将10mg甲基红溶于30mL95%乙醇中，加入20mL蒸馏水，混匀。

A.7.3.3试验方法

取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水中，36℃±1℃培养2d～5d。滴加甲基红试剂一

滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。

A.7.4V-P试验

A.7.4.16%α-萘酚-乙醇溶液

成分及制法:

取α-萘酚6.0g，加无水乙醇溶解，定容至100mL。

A.7.4.240%氢氧化钾溶液

成分及制法:

取氢氧化钾40g，加蒸馏水溶解，定容至100mL。

A.7.4.3试验方法

取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水中，36℃±1℃培养2d～4d。加入6%α-萘酚-

乙醇溶液0.5mL和40%氢氧化钾溶液0.2mL,充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内

出现红色，如为阴性，应放在36℃±1℃继续培养1h再进行观察。

11

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A.8血琼脂

A.8.1成分

蛋白胨