CN110564788A 一种利用亚胺还原酶生产麻黄碱的方法 （江南大学）

代理有限公司23211本发明公开了一种利用亚胺还原酶生产麻方法以(R)-1-苯基-2-羰基-3-丙醇与甲胺为反应原料反应18h,即可使反应液中麻黄碱的产率高达86.5%,利用此方法以苯甲醛、丙酮酸与甲胺为反应原料反应18h,即可使反应液中麻黄碱的产率高达62.7%,因此，利用此方法生产麻黄21.一种生产麻黄碱的方法，其特征在于，所述方法为以(R)-1-苯基-2-羰基-3-丙醇与甲胺为反应原料，将(R)-1-苯基-2-羰基-3-丙醇与甲胺在亚胺还原酶或表达亚胺还原酶的基因工程菌的作用下进行反应，得到(1R,2S)-2-甲氨基-苯丙烷-1-醇，即麻黄碱；或者，所述方法为以苯甲醛、丙酮酸与甲胺为反应原料，将苯甲醛、丙酮酸与甲胺在亚胺还原酶或表达亚胺还原酶的基因工程菌，和，丙酮酸脱羧酶或表达丙酮酸脱羧酶的基因工程菌的共同作用下进行反应，得到(1R,2S)-2-甲氨基-苯丙烷-1-醇，即麻黄碱。2.如权利要求1所述的一种生产麻黄碱的方法，其特征在于，所述亚胺还原酶为氨基酸序列如SEQIDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13或SEQIDNo.14所示的亚胺还原酶中的一种或多种。3.如权利要求1或2所述的一种生产麻黄碱的方法，其特征在于，所述丙酮酸脱羧酶为氨基酸序列如SEQIDNo.15或SEQIDNo.16所示的亚胺还原酶中的一种或多种。4.如权利要求1-3任一所述的一种生产麻黄碱的方法，其特征在于，所述方法为以(R)-1-苯基-2-羰基-3-丙醇与甲胺为反应原料，先将(R)-1-苯基-2-羰基-3-丙醇与甲胺加入缓冲液中，得到反应体系，然后在反应体系中加入亚胺还原酶或表达亚胺还原酶的基因工程菌进行反应，得到(1R,2S)-2-甲氨基-苯丙烷-1-醇，即麻黄碱；或者，所述方法为以苯甲醛、丙酮酸与甲胺为反应原料，先将苯甲醛、丙酮酸与甲胺加入缓冲液中，得到反应体系，然后在反应体系中加入亚胺还原酶或表达亚胺还原酶的基因5.如权利要求4所述的一种生产麻黄碱的方法，其特征在于，当反应原料为(R)-1-苯基-2-羰基-3-丙醇与甲胺时，所述反应体系中还含有葡萄糖脱氢酶、葡萄糖、第一辅酶以及二甲基亚砜，或者，所述反应体系中还含有表达葡萄糖脱氢酶的基因工程菌、葡萄糖、第一辅酶以及二甲基亚砜；当反应原料为苯甲醛、丙酮酸与甲胺时，所述反应体系中还含有葡萄糖脱氢酶、葡萄糖、第一辅酶、第二辅酶以及二甲基亚砜，或者，所述反应体系中还含有表达葡萄糖脱氢酶6.如权利要求5所述的一种生产麻黄碱的方法，其特征在于，所述第一辅酶为NADPH和/7.如权利要求5或6所述的一种生产麻黄碱的方法，其特征在于，所述第二辅酶为焦磷酸硫胺素。8.如权利要求4-7任一所述的一种生产麻黄碱的方法，其特征在于，所述反应体系中，亚胺还原酶的浓度为1.2～30U/mL。9.如权利要求4-8任一所述的一种生产麻黄碱的方法，其特征在于，所述反应体系中，可表达亚胺还原酶的基因工程菌的浓度为16～50g/L。10.亚胺还原酶或表达亚胺还原酶的基因工程菌或权利要求1-9任一所述的一种生产麻黄碱的方法在生产麻黄碱中的应用。3技术领域[0001]本发明涉及一种利用亚胺还原酶生产麻黄碱的方法，属于生物技术领域。背景技术[0002]中药麻黄具有良好的药用价值，且具有用药安全可靠、耐受性强、副作用小的优点。它的主要有效成分为麻黄碱(ephedrine)和伪麻黄碱。其中，麻黄碱属于拟肾上腺激动平滑肌、收缩血管、加速心率、升高血压及中枢神经兴奋作用，被应用在许多感冒药中；另肥中有巨大的应用前景。[0003]目前，对麻黄碱的生产，国内主要采用植物提取法直接从麻黄草中提取麻黄碱，但是，由于麻黄草资源限制，大多数麻黄碱生产企业因原料不足而处于半停产状态，麻黄碱产量不足已严重影响了我国医药企业的发展和麻黄碱类药品在国际市场上的竞争力。国内外也有部分厂家，例如，深圳沃兰德和内蒙古赤峰等，使用化学合成法生产麻黄碱，此方法为先生产L-麻黄碱和D-伪麻黄碱的外消旋体，然后将生产得到的外消旋体进行拆分，但是，此方法所使用的拆分试剂价格昂贵，成本过高。[0004]与植物提取法和化学合成法相比，生物转化法天然具有原料来源广以及生产成本低的优势。为解决麻黄碱生产过程中原料不足以及生产成本高的问题，1921年，Neuberg等人采用酵母转化苯甲醛和丙酮酸生产得到了L-苯基乙酰基甲醇(具体可参考文献：NeubergC,LibermannL.ZurKenntnisderCarboligase[随后，Hildebrandt等人继续将L-苯基乙酰基甲醇与甲基胺反应合成了麻黄碱(具体可参考1956930(C.A.-28:4072),1934-05-01.),这首次实现了麻黄碱的半生物转化。[0005]但是，上述方法依旧存在产量低以及生产得到的麻黄碱杂质过多的缺陷，并不能实现真正的工业化生产。因此，仍需找到一种操作简单、产量高、生产成本低且生产得到的麻黄碱杂质少、稳定性好的生产麻黄碱的方法，以早日实现麻黄碱的工业化生产。发明内容[0007]本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、产量高、生产成本低且生产得到的麻黄碱杂质少、稳定性好的生产麻黄碱的方法。[0008][技术方案][0009]为解决上述技术问题，本发明提供了一种生产麻黄碱的方法，所述方法为以(R)-1-苯基-2-羰基-3-丙醇与甲胺为反应原料，将(R)-1-苯基-2-羰基-3-丙醇与甲胺在亚胺还原酶或表达亚胺还原酶的基因工程菌的作用下进行反应，得到(1R,2S)-2-甲氨基-苯丙烷-4[0010]或者，所述方法为以苯甲醛、丙酮酸与甲胺为反应原料，将苯甲醛、丙酮酸与甲胺在亚胺还原酶或表达亚胺还原酶的基因工程菌，和，丙酮酸脱羧酶或表达丙酮酸脱羧酶的基因工程菌的共同作用下进行反应，得到(1R,2S)-2-甲氨基-苯丙烷-1-醇，即麻黄碱。[0011]在本发明的一种实施方式中，所述亚胺还原酶为氨基酸序列如SEQIDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13或SEQIDNo.14所示的亚胺还原酶中的一种或多种。[0012]在本发明的一种实施方式中，所述丙酮酸脱羧酶为氨基酸序列如SEQIDNo.15或SEQIDNo.16所示的亚胺还原酶中的一种或多种。[0013]在本发明的一种实施方式中，所述方法为以(R)-1-苯基-2-羰基-3-丙醇与甲胺为反应原料，先将(R)-1-苯基-2-羰基-3-丙醇与甲胺加入缓冲液中，得到反应体系，然后在反应体系中加入亚胺还原酶或表达亚胺还原酶的基因工程菌进行反应，得到(1R,2S)-2-甲氨[0014]或者，所述方法为以苯甲醛、丙酮酸与甲胺为反应原料，先将苯甲醛、丙酮酸与甲胺加入缓冲液中，得到反应体系，然后在反应体系中加入亚胺还原酶或表达亚胺还原酶的基因工程菌，和，丙酮酸脱羧酶或表达丙酮酸脱羧酶的基因工程菌进行反应，得到(1R,2S)-2-甲氨基-苯丙烷-1-醇，即麻黄碱。[0015]在本发明的一种实施方式中，当反应原料为(R)-1-苯基-2-羰基-3-丙醇与甲胺应体系中还含有表达葡萄糖脱氢酶的基因工程菌、葡萄糖、第一辅酶以及二甲基亚砜；[0016]当反应原料为苯甲醛、丙酮酸与甲胺时，所述反应体系中还含有葡萄糖脱氢酶、葡萄糖、第一辅酶、第二辅酶以及二甲基亚砜，或者，所述反应体系中还含有表达葡萄糖脱氢[0018]在本发明的一种实施方式中，所述第二辅酶为焦磷酸硫胺素。[0019]在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，亚胺还原酶的浓度为1.2～30U/[0020]在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，可表达亚胺还原酶的基因工程菌的浓度为16～50g/L。[0021]在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，丙酮酸脱羧酶的浓度为2～12U/[0022]在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，可表达丙酮酸脱羧酶的基因工程菌的浓度为20～80g/L。[0023]在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，葡萄糖脱氢酶的浓度为1～8U/mL。[0024]在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，可表达葡萄糖脱氢酶的基因工程菌的浓度为14～56g/L。[0025]在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，葡萄糖的浓度为50～300g/L。[0026]在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，第一辅酶的浓度为0.4～5g/L。[0027]在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，第二辅酶的浓度为0.01～25mmol/[0028]在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，二甲基亚砜的浓度为5～20%(v/5[0029]在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为20～35℃、pH为6.5～8.5、转速为[0030]在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tri-[0031]在本发明的一种实施方式中，所述表达亚胺还原酶的基因工程菌以大肠杆菌为表[0032]在本发明的一种实施方式中，所述表达丙酮酸脱羧酶的基因工程菌以大肠杆菌为[0033]本发明还提供了亚胺还原酶或表达亚胺还原酶的基因工程菌或上述一种生产麻黄碱的方法在生产麻黄碱中的应用。[0034]在本发明的一种实施方式中，所述亚胺还原酶为氨基酸序列如SEQIDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13或SEQIDNo.14所示的亚胺还原酶中的一种或多种。[0036](1)本发明提供了一种利用亚胺还原酶生产麻黄碱的方法，利用此方法以(R)-1-苯基-2-羰基-3-丙醇与甲胺为反应原料反应18h,即可使反应液中麻黄碱的产率高达86.5%,利用此方法以苯甲醛、丙酮酸与甲胺为反应原料反应18h,即可使反应液中麻黄碱的产率高达62.7%,因此，利用此方法生产麻黄碱具有产量高的优势。[0037](2)本发明提供了一种利用亚胺还原酶生产麻黄碱的方法，利用此方法以(R)-1-苯基-2-羰基-3-丙醇与甲胺为反应原料生产得到的麻黄碱的光学纯度高达99.6%,利用此方法以苯甲醛、丙酮酸与甲胺为反应原料生产得到的麻黄碱的光学纯度高达92.1%,因此，利用此方法生产得到的麻黄碱杂质含量少、稳定性好。[0038](3)本发明提供了一种利用亚胺还原酶生产麻黄碱的方法，利用此方法可以(R)-1-苯基-2-羰基-3-丙醇与甲胺，或者，苯甲醛、丙酮酸与甲胺为反应原料生产麻黄碱，这些反应原料易获得且获得成本较低，因此，利用此方法生产麻黄碱具有成本低的优势。[0039](4)本发明提供了一种利用亚胺还原酶生产麻黄碱的方法，利用此方法生产麻黄碱仅需将相关原料和相关酶或可表达相关酶的相关基因工程菌投入反应体系中即可完成，因此，利用此方法生产麻黄碱具有操作简单的优势。具体实施方式[0040]以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但该实施例不应该理解为对[0041]下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)购自北纳生物；下甲基亚砜购自国药集团；述实施例中涉及的葡萄糖脱氢酶购自上海研生生化试剂有限公[0042]下述实施例中涉及的培养基如下：6[0046](R)-1-苯基-2-羰基-3-丙醇产率以及光学纯度的检测方法：参考文献"ContinuousProductionReactorUsingaPotentMutantofPyruvatEenoo,F.T.Delbeke,DevelopmentandvalidationofanLC-MS/MSquantificationofephedrinesinurine,JChromatogr[0048]下述实施例中涉及的可表达丙酮酸脱羧酶的基因工程菌以及(R)-1-苯基-2-羰将其与质粒pET-28a(+)相连，获得重组质粒pETXhoI双酶切后进行电泳验证，并对质粒进行测序验证，验证正确，获得重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a200rpm的条件下培养至OD在0.4～0.850g/L,硫胺素焦磷酸的浓度为2.5mmol/L,MgCl2的浓度为5mmol/L,二甲基亚砜的浓度为5为31.4～86.7%,光学纯度为95.7～99.4%((R)-1-苯基2-羰基-3-丙醇的纯化方法参考文7[0054]将反应液离心收集上清，将上清用浓度为10mol/L的NaOH溶液调节pH为8,用旋转蒸发仪将上清浓缩至体积为1/2,再用浓度为10mol/L的HC1溶液调节pH为7,0～8℃下放置12～14h,过滤收集固体，将所得固体融入浓度为1mol/L的NaOH溶液中，再用浓度为10mol/L的HCl溶液调节pH为7,加入乙醇进行结晶，收集结晶，洗涤后进行真空干燥，得到麻黄碱晶[0055]实施例1:可表达亚胺还原酶的基因工程菌的构建[0056]化学合成编码氨基酸序列分别如SEQIDNo.1～SEQIDNo.14所示的亚胺还原酶的基因，并将其与质粒pET-28a(+)相连，获得重组质粒pET-28a(+)-ired1～pET-28a(+)-ired14,此步骤由南京金斯瑞生物科技有限公司完成；[0057]将获得的重组质粒pET-28a(+)-ired1～pET-28a(+)-ired14分别导入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中；将转化后的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)划线于含有素的LB固体培养基上，于37℃的条件下培养20～24h;挑取阳性转化子接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm的条件下培养12～14h,收集菌体，提取质粒，将质粒经限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切后进行电泳验证，并对质粒进行测序验证，验证正确，获得重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired1～重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-[0058]将重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired1～重组大肠杆菌E.coli℃的条件下培养20～24h,获得单菌落；挑取单菌落接种于添加了50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm的条件下培养6～8h,获得种子液；将种子液以2～10%(v/v)的0.4～0.8之间后，在培养液中加入终浓度为0.1～1mmol/L的IPTG,于17～28℃的条件下继续进行诱导12～20h,获得发酵液；将发酵液进行离心，收集菌体，得到重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired1～重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired14全[0059]实施例2:麻黄碱的制备[0060]以含有空质粒pET-28a(+)的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)为空白对照，以(R)-1-苯基-2-羰基3-丙醇(30g,0.2mol)、甲胺(62g,2mol)和葡萄糖(36g,0.2mol)为底物，以磷酸盐缓冲液为溶剂，分别以实施例1获得的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired1~重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired14全细胞和葡萄糖脱氢酶共同作为度为25℃、pH值为8.5、转速为200rpm的条件下进行反应18h,获得含有麻黄碱的反应液；反应体系中，重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired全细胞的浓度为34g/L,NADP的浓度为0.4g/L,二甲基亚砜的浓度为10%(v/v)。检测反应液中麻黄碱的产率，结果发现：空白对照组获得的反应液中不能检测到麻黄碱；以重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired1～重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired10全细胞为催化剂获得的反应液中也不能检测到麻黄碱；以重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired11全细胞为催化剂时，产率为62.9～67.3%;以重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired12全细胞为催化剂时，产率为9.2～11.3%;以重组大肠杆菌E.coliBL218(DE3)/pET-28a(+)-ired13全细胞为催化剂时，产率为34.6～42.8%;以重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired14全细胞为催化剂时，产率为77.9～86.5%。[0061]将以重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired11～重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired14全细胞为催化剂时获得的反应液中的麻黄碱进行纯化，得到麻黄碱晶体。检测麻黄碱晶体的光学纯度，结果发现：光学纯度为99.1～99.6%。[0062]实施例3:麻黄碱的制备[0063]以苯甲醛(31.8g,0.3mol)、丙酮酸(17.6g,0.2mol)、甲胺(31g,1mol)和葡萄糖(45g,0.25mol)为底物，以磷酸盐缓冲液为溶剂，分别以实施例1获得的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired11～重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired14全细胞、可表达丙酮酸脱羧酶的基因工程菌和葡萄糖脱氢酶共同作为催化剂，以焦温度为25℃、pH值为7.5、转速为200rpm的条件下进行反应26h,获得含有麻黄碱的反应液；反应体系中，可表达丙酮酸脱羧酶的基因工程菌的浓度为50g/L,重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired全细胞的浓度为42g/L,焦磷酸硫胺素的浓度为3.2mmol/L,NADP+的浓度为0.45g/L,二甲基亚砜的浓度为10%(v/v)。检测反应液中麻黄碱的产率，结果发现：以重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired11全细胞为催化剂时，产率为42.6～59.7%;以重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired12全细胞为催化剂时，产率为3.1～6.2%;以重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired13全细胞为催化剂时，产率为19.8～22.6%;以重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired14全细胞为催化剂时，产率为48.5～62.7%。[0064]将以重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired11～重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ired14全细胞为催化剂时获得的反应液中的麻黄碱进行纯化，得到麻黄碱晶体。检测麻黄碱晶体的光学纯度，结果发现：光学纯度为81.4～92.1%。[0065]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。CN110564788A序列表1/21页9<110>江南大学<120>一种利用亚胺还原酶生产麻黄碱的方法<213>人工序列MetGlyAspAsnArgThrAlaValGlnAlaAlaThrProAlaAMetTrpLeuGlu210215CN110564788A序列表2/21页225230245250260262752<213>人工序列CN110564788A序列表3/21页11AsnGlyVal210215225230245250260262752<213>人工序列GlyAlaValLeuCN110564788A序列表4/21页12PheAspAlaHisHisAlaAlaLeuALeuGlyThrGluProGlyGlyLeuMetTrp210215ArgTrpLeuGlyThrValAsnAsn225230ValAspGluGlyValTyrProGly2452502602627528290ArgLysGlyAlaA<213>人工序列AlaIleArgValSerThCN110564788A序列表5/21页AspThrProGluLysAlaArgLy210215225230AspGluGlyGluHisProG24525026026IleAlaLeuProAlaThrVal275280290<213>人工序列GlyLeuGlyAlaMGlyLysArgValAlaIleCN110564788A序列表6/21页2102122523024525026026275280AlaIleThrLeuSe<213>人工序列CN110564788A序列表7/21页ArgThrArgGlnLysThrAspProGlyGluGluProGlyArgAl210215225230245250GlyIleAspArgSerI260262752<213>人工序列CN110564788A序列表8/21页AlaGlnArgGlyAlaAr210215TyrAlaProGlnValAspGl22523024525026026AspArgAlaAlaAlaAspGlyArgAla275280CN110564788A序列表9/21页<213>人工序列AlaAlaSerValArgAsnAlaIleArgTyrLeuAspGlyAlaThrAlaProValIle210215225230245250GlyIleAspArg26026CN110564788A序列表10/21页275<213>人工序列<223>Xaacanbeanyn<223>Xaacanbeanyn<223>Xaacanbeanyn<223>Xaacanbeanyn<223>Xaacanbeanyn<223>XaacanbeanynCN110564788A序列表11/21页21021522523024525026026275280290<213>人工序列MetThrAspGlnCN110564788A序列表12/21页GlySerAlaLeuAlaAlaAlaArgGlnAlaAspAspIleLeuValValCysLeuAlaProAlaArgGluAlaLeuArgGlyArgValGlyThrProLysGl210215225230245250ValAspThrGluIleProValArgAsnLys260262752CN110564788A序列表13/21页21<213>人工序列AlaSerTyrLeuAsGlyGluGluSerGlyA