动物寄生虫检测作业指导书

动物寄生虫检测作业指导书一、概述

动物寄生虫检测是评估动物健康状况、预防疾病传播的重要手段。本指导书旨在提供一套标准化、系统化的检测流程，确保检测结果的准确性和可靠性。通过规范操作，可提高工作效率，降低人为误差。

二、检测前的准备

（一）仪器设备

1.显微镜：配备10×、40×物镜，放大倍数可达400×。

2.载玻片与盖玻片：清洁无划痕，干燥备用。

3.涂片器：一次性或无菌金属刮片。

4.样品保存液：生理盐水、10%甲醛溶液或专用保存液。

5.标记笔：用于记录样本编号。

（二）试剂与耗材

1.生理盐水：0.9%氯化钠溶液。

2.甘油：分析纯，用于固定样本。

3.消毒用品：75%酒精或消毒湿巾。

（三）样本采集

1.选择健康个体进行采样，避免应激反应。

2.常见采样部位及方法：

(1)粪便样本：使用无菌棉签或一次性粪便采集器，取新鲜粪便约5g。

(2)血液样本：选择耳缘静脉或心脏采血，抗凝后置于专用管中。

(3)体表寄生虫：使用镊子或刮片采集皮屑、跳蚤等。

三、检测步骤

（一）粪便样本检测

1.**样品制备**

(1)取粪便样本置于载玻片上，加入1-2滴生理盐水。

(2)用涂片器均匀涂抹，厚度适中，避免堆积。

2.**显微镜观察**

(1)盖上盖玻片，轻压使其完全覆盖。

(2)先用10×物镜寻找虫卵、幼虫或原虫，再用40×物镜详细观察形态。

3.**结果记录**

(1)记录虫种、数量及形态特征。

(2)高倍镜下拍摄图像，辅助鉴定。

（二）血液样本检测

1.**血涂片制备**

(1)用毛细血管采血器取血，沿玻片边缘均匀涂抹。

(2)自然晾干或用吹风机冷风加速干燥。

2.**染色与封片**

(1)使用Giemsa染色液染色5-10分钟。

(2)加入甘油封片液，盖上盖玻片。

3.**显微镜观察**

(1)先用10×物镜定位，再用40×物镜观察血细胞内寄生虫（如疟原虫）。

(2)计数视野内虫体数量，计算感染率。

（三）体表寄生虫检测

1.**皮屑检查**

(1)用刮片轻刮背部皮屑，混入生理盐水制片。

(2)显微镜下观察螨虫、虱子等体表寄生虫。

2.**跳蚤等节肢动物**

(1)直接置于玻片上，滴加甘油压扁观察。

(2)注意虫体口器、足肢等特征。

四、质量控制

（一）阳性对照

每次检测需设置已知阳性样本，验证操作有效性。

（二）重复性验证

同一样本重复检测2次，结果一致性达90%以上方可记录。

（三）操作规范

1.每次检测后用75%酒精消毒仪器表面。

2.样本标记清晰，避免混淆。

五、结果报告

（一）记录格式

1.样本编号、检测日期、检测人。

2.虫种、数量、感染程度（轻度/中度/重度）。

（二）异常处理

1.若发现未知寄生虫，送专业机构进一步鉴定。

2.检测失败（如染色失败）需重新制片。

六、注意事项

1.严格无菌操作，防止交叉污染。

2.显微镜使用后及时清洁，物镜镜头用专用擦镜纸擦拭。

3.检测完毕后，废弃物按生物危害物处理。

**一、概述**

动物寄生虫检测是评估动物健康状况、预防疾病传播、制定科学防治策略的重要技术手段。通过系统性的检测，可以了解动物体内或体表的寄生虫种类、数量和感染程度，为后续的药物治疗、健康管理提供依据。本指导书旨在提供一个标准化、系统化的检测流程，旨在确保检测操作的规范性、结果的准确性和可靠性。遵循本指导书，有助于提高检测工作效率，减少人为误差，为动物的健康管理提供有力支持。检测方法主要包括粪便检查、血液检查、体表检查等多种方式，具体选择应根据检测目的和动物种类确定。

**二、检测前的准备**

充分的准备工作是保证检测顺利进行和结果准确的基础。

（一）仪器设备

1.**显微镜**：

(1)应配备体视显微镜（低倍，用于初步查找）和普通光学显微镜（高倍，用于详细观察和鉴定）。

(2)显微镜应保持清洁，物镜和目镜无灰尘或油污，必要时使用专用擦镜纸和清洁液进行清洁。

(3)确保显微镜光源亮度可调，视野清晰。

2.**载玻片与盖玻片**：

(1)使用无划痕、无油污的洁净载玻片和盖玻片。

(2)可准备专用的标记载玻片，用于记录样本编号等信息。

(3)建议使用一次性盖玻片，以减少交叉污染风险。

3.**涂片器/刮片**：

(1)根据样本类型选择合适的涂片器（如塑料刮片、金属刮片）或专用梳子（如用于皮屑采集）。

(2)金属刮片应光滑无锈，一次性使用或严格消毒后使用。

4.**样品保存液/固定液**：

(1)**生理盐水**（0.9%氯化钠溶液）：用于稀释粪便样本、制作血涂片前的血液稀释、皮屑湿片制作等，可抑制某些细菌生长，便于观察活动虫体或卵。

(2)**10%甲醛溶液**：适用于固定粪便样本，特别是需要长期保存或进行特殊染色（如H&E染色）时，能更好地保存虫卵形态。

(3)**专用保存液**：某些特定寄生虫检测（如原虫）可能需要使用商业化的保存液，需按说明书使用。

5.**染色剂**：

(1)**Giemsa染色液**：主要用于血液样本，染色血液细胞内的寄生虫（如疟原虫、巴贝斯虫等），可显示虫体的形态和染色特性。

(2)**亚甲基蓝或苏木精**：有时用于粪便样本中某些原虫（如蓝氏贾第鞭毛虫）的染色。

(3)染色剂需按规定比例配制，并定期检查浓度，确保染色效果。

6.**其他辅助工具**：

(1)**酒精灯或消毒喷雾**：用于手部和操作台面的消毒。

(2)**标记笔/标签**：用于标记样本容器和载玻片，信息应清晰、持久。

(3)**镊子**：用于夹取载玻片、盖玻片等，建议使用无菌镊子。

(4)**离心机**（如需）：用于血液样本处理，提高寄生虫检出率。

(5)**烘箱/温箱**（如需）：用于血涂片干燥或某些特殊样本处理。

（二）试剂与耗材

1.**生理盐水**：

(1)可自行配制（氯化钠3g溶于1000mL蒸馏水或去离子水），或使用商业无菌生理盐水。

(2)配制后需密封保存，防止污染和蒸发。

2.**消毒用品**：

(1)**75%酒精**：用于手部消毒、工作台面消毒、仪器表面清洁。

(2)**消毒湿巾**：方便快捷地进行表面消毒。

(3)**过氧化氢/次氯酸钠**（按说明稀释）：用于废弃物的消毒处理。

3.**其他耗材**：

(1)**一次性手套**：必须佩戴，防止交叉污染，建议操作全程佩戴。

(2)**吸水纸/擦镜纸**：用于清洁载玻片、吸去多余液体。

(3)**培养皿/皿皿架**：用于放置湿片样本，便于显微镜观察。

(4)**样本保存管/袋**：用于临时或长期保存样本，需密封防潮。

（三）样本采集

1.**采样原则**：

(1)选择健康状况良好、行为正常的个体进行采样，避免在动物应激状态下采样。

(2)采样环境应清洁、避光，减少外界污染。

(3)严格遵守生物安全操作规程，防止病原体传播。

2.**粪便样本采集**：

(1)**工具准备**：无菌粪便采集勺、一次性棉签、标记好的样本袋/管、消毒用品。

(2)**采样方法**：

-**新鲜粪便**：从直肠深处或粪便堆取约5-10克，放入无菌袋或管中。

-**隐匿感染检测**：可使用粪便漂浮法，需采集全部粪便。

(3)**注意事项**：

-避免混入尿液、泥土等杂质。

-样本采集后应尽快处理或冷藏（4°C以下），一般建议在4小时内检测完毕，否则需冷藏保存（不超过24小时）。

3.**血液样本采集**：

(1)**工具准备**：毛细血管采血器（如玻片法）、血液收集管（如EDTA抗凝管）、酒精棉球、止血钳、消毒手套。

(2)**采样部位**：根据动物种类选择耳缘静脉、股静脉、前腔静脉等。

(3)**采样方法**（以耳缘静脉为例）：

-用酒精棉球消毒采血部位，待酒精挥发。

-用止血钳轻压耳根处，使静脉充盈。

-用毛细血管采血器采血，沿玻片边缘均匀涂抹，注意涂抹厚度均匀，避免堆积。

-采血后用酒精棉球按压止血。

(4)**抗凝**：若需制备血涂片，采血时需加入适量抗凝剂（如肝素），或直接在洁净玻片上采血后立即制作涂片。

(5)**注意事项**：

-严格无菌操作，防止溶血和污染。

-采血量根据检测需求确定，避免对动物造成过度伤害。

4.**体表寄生虫采集**：

(1)**工具准备**：消毒镊子、刮片、透明胶带、样本袋、酒精。

(2)**采样部位**：耳道内壁、腋下、腹股沟、颈部等易寄生蠕虫或节肢动物的部位。

(3)**采样方法**：

-**跳蚤**：用镊子夹取跳蚤放入酒精中固定，或用透明胶带粘取跳蚤卵、成虫。

-**螨虫/皮屑**：用消毒刮片轻刮皮屑，置于载玻片上加生理盐水制作湿片，或用透明胶带擦拭皮肤后揭下，贴在载玻片上观察。

-**蜱虫**：用镊子完整夹取蜱虫，放入酒精中。

(4)**注意事项**：

-采样时注意观察动物反应，避免过度抓挠。

-样本应立即处理或保存，避免干燥死亡。

**三、检测步骤**

（一）粪便样本检测

1.**样品制备**

(1)**粪便直接涂片法**：

-取约少量（约黄豆大小）粪便样本置于洁净载玻片中央。

-滴加1-2滴生理盐水，用涂片器或手指（需戴手套）将粪便与生理盐水混合均匀，制成薄层涂片。

-避免样本过厚，影响观察。

(2)**粪便漂浮法**（用于隐匿感染检测）：

-将全部粪便样本放入有水的容器中充分研磨。

-将混合液通过滤网（如纱布）过滤到装有漂浮液（如饱和盐水或专用漂浮液）的离心管或培养皿中。

-静置10-15分钟后，用滴管吸取漂浮液表面漂浮的虫卵、幼虫或原虫，滴在载玻片上，加生理盐水或甘油，盖上盖玻片。

(3)**粪便沉淀法**：

-将粪便样本加入试管中，加适量水搅拌，静置30分钟以上。

-倒掉上层清液，保留沉淀物。

-将沉淀物用生理盐水稀释后涂片或制作湿片。

2.**显微镜观察**

(1)**低倍镜初查**（10×物镜）：

-先在低倍镜下快速扫描整个视野，寻找可疑虫卵、幼虫、原虫或成虫（如蛔虫、钩虫卵等较大虫体）。

-注意观察样本的背景，如白细胞、红细胞等。

(2)**高倍镜细查**（40×或100×物镜）：

-对低倍镜发现的阳性区域或可疑目标进行放大观察。

-详细记录虫体形态、大小、颜色、内部结构（如卵壳纹理、幼虫特征、原虫运动方式等）。

-可使用目镜测微尺测量虫体大小，提高鉴定准确性。

(3)**计数与统计**（如需）：

-对于需要评估感染强度的检测（如线虫），可在一定视野范围内（如10×40视野）计数虫卵数量，计算每克粪便虫卵数（EPG）。

3.**结果记录与报告**

(1)记录样本编号、检测日期、检测人。

(2)详细描述发现的寄生虫种类、数量、形态特征。

(3)如发现多种寄生虫，按种类和数量进行分类记录。

(4)如未发现寄生虫，应记录为“阴性”。

(5)必要时拍摄显微镜图像，辅助记录和后续鉴定。

（二）血液样本检测

1.**血涂片制备**

(1)**玻片准备**：清洁载玻片，可在其一端做标记。

(2)**采血量**：根据动物种类和抗凝剂选择，通常需1-2滴血。

(3)**涂抹方法**（玻片法）：

-将采血器（如毛细血管采血器）置于玻片一端，另一端用拇指按压，使血液沿玻片边缘流出。

-将另一张洁净玻片紧贴有血液流出的一端，轻轻将两片玻片以约30-45度角向相反方向拉动，血液被拉成一条均匀的细线。

-拉动过程中保持速度稳定，使血膜厚度适中（通常宽度约1-1.5mm）。

(4)**注意事项**：

-避免涂抹过宽或过窄，过宽易重叠，过窄不易观察。

-避免用力过猛导致血细胞破裂。

-采血后应立即制作涂片，避免血液凝固。

2.**染色与封片**

(1)**干燥**：将制备好的血涂片自然晾干，避免热风加速干燥导致细胞变形。干燥时间通常需30分钟以上。

(2)**染色**（以Giemsa染色为例）：

-将干燥的血涂片置于染色架上，滴加Giemsa染色液，完全覆盖血膜。

-根据染色液说明书和经验，染色时间通常为20-30分钟。

-可在染色过程中轻摇染色架，使染色均匀。

-染色完成后，用蒸馏水或缓冲液冲洗（或直接用流水冲去浮色），也可用吸水纸吸去多余水分。

(3)**封片**：

-待涂片稍干后，滴加1-2滴甘油封片剂，滴在盖玻片中央。

-小心缓慢地盖上盖玻片，避免产生气泡。可用橡皮擦轻轻拍打盖玻片边缘，使甘油均匀分布并压紧。

(4)**注意事项**：

-染色时间和温度需严格控制，影响染色效果。

-封片剂应无气泡，否则影响显微镜观察。

3.**显微镜观察**

(1)**低倍镜定位**（10×物镜）：

-先找到染色均匀、细胞分布适中的区域。

-注意寻找形态异常的血细胞或细胞内的inclusion（包涵体）。

(2)**高倍镜观察**（40×或100×物镜）：

-重点观察白细胞（特别是嗜酸性粒细胞、淋巴细胞），寻找其中的寄生虫。

-**疟原虫**：观察其典型的环状体、裂殖体、配子体等，注意其宿主细胞（红细胞）内的形态特征。

-**巴贝斯虫**：观察其在红细胞内的阿米巴样运动，注意感染红细胞的大小变化。

-**附红细胞体**：观察其附着在红细胞表面，随红细胞一起运动。

-**弓形虫**：在浆细胞或巨噬细胞内寻找其速殖子或包囊。

(3)**计数与统计**（如需）：

-在一定数量的视野（如20个油镜视野）内计数寄生虫数量，结合白细胞计数或红细胞计数，计算感染率或寄生虫密度。

4.**结果记录与报告**

(1)记录样本编号、检测日期、检测人、抗凝剂类型。

(2)详细描述发现的寄生虫种类、数量、形态特征、感染部位（细胞内或细胞外）。

(3)如未发现寄生虫，应记录为“阴性”。

(4)必要时拍摄显微镜图像。

（三）体表寄生虫检测

1.**皮屑/刮取物湿片检查**

(1)**制备方法**：

-取少量皮屑或刮取物置于载玻片上，滴加1-2滴生理盐水。

-用涂片器或刮片将样本均匀涂抹开，制成湿片。

-盖上盖玻片，轻压使其完全接触。

(2)**显微镜观察**（10×-40×物镜）：

-重点观察皮屑细胞、毛囊、皮脂腺等结构。

-寻找螨虫（注意其蠕虫状形态、足肢）、蜱虫（完整或碎片）、蠕形螨（通常在毛囊内）等。

-观察是否有大量嗜酸性粒细胞聚集，可能提示过敏或寄生虫感染。

3.**透明胶带法检查**

(1)**采样方法**：

-取一条清洁的透明胶带（宽度约1cm），在动物背部、腋下、腹股沟等易寄生部位来回粘贴数次，粘取皮屑和可能附着的虫卵、幼虫或螨虫。

-将粘有样本的胶带平整贴在洁净载玻片上，或直接在显微镜下观察。

(2)**显微镜观察**（10×-40×物镜）：

-观察胶带上粘附的皮屑细节。

-寻找螨虫、跳蚤卵、幼虫、成虫（注意跳蚤的形态特征）等。

-胶带法对于检查跳蚤感染特别有效。

4.**直接观察/捕捉**

(1)**直接观察**：在光线较暗处观察动物体表，有时可见活动的跳蚤。

(2)**捕捉**：用镊子小心捕捉可见的蜱虫、虱子等，置于酒精中固定或直接观察。

5.**结果记录与报告**

(1)记录样本编号、检测日期、检测人、采样部位。

(2)详细描述发现的寄生虫种类（如螨虫、跳蚤等）、数量、形态特征。

(3)如未发现寄生虫，应记录为“阴性”。

**四、质量控制**

确保检测结果的准确性和可靠性是质量控制的核心。

（一）阳性对照**

1.**设置目的**：验证检测流程（试剂、操作）是否正常工作，排除假阴性结果。

2.**设置方法**：

(1)使用已知含有目标寄生虫的阳性样本（如保存良好的阳性粪便、血液或虫体）。

(2)按照与实际样本相同的步骤进行检测。

3.**结果判断**：阳性对照必须成功检出目标寄生虫，否则应立即检查原因（试剂、操作等）并重新检测。

（二）阴性对照**

1.**设置目的**：排除试剂污染、样本间交叉污染等导致的假阳性结果。

2.**设置方法**：

(1)**空白对照**：不加任何样本，只加试剂进行染色，观察是否有非特异性染色。

(2)**空白样本对照**：使用不含目标寄生虫的健康动物样本（如阴性粪便、血液），按标准流程检测。

3.**结果判断**：阴性对照必须为阴性，否则应检查并排除污染源。

（三）重复性验证**

1.**设置目的**：评估检测结果的稳定性和一致性。

2.**设置方法**：

(1)对同一份样本（或模拟样本）进行至少两次独立的检测。

(2)检测应在不同时间或由不同操作者进行（如果条件允许）。

3.**结果判断**：两次检测结果应具有高度一致性（例如，寄生虫检出率或数量差异在允许范围内，如±10%）。若结果不一致，需查找原因并重测。

（四）操作规范**

1.**手部卫生**：操作前后必须彻底洗手，佩戴一次性手套，避免手部污染。

2.**仪器清洁**：显微镜物镜、目镜等光学部件需定期清洁，工作台面保持清洁干燥。

3.**样本管理**：样本标记清晰明确，防止混淆；需保存的样本应妥善保存，避免变质或污染。

4.**废弃物处理**：所有废弃物（如沾染样本的棉签、玻片、手套等）必须放入指定的高风险废弃物容器中，按生物安全规定进行处理（如高压灭菌、焚烧等），严禁随意丢弃。

5.**记录完整**：所有检测步骤、观察结果、计算数据等均需详细、准确记录在实验记录本或电子系统中。

**五、结果报告**

检测结果报告是向用户（如养殖户、兽医）传递信息的关键环节，应清晰、准确、规范。

（一）报告内容**

1.**基本信息**：

(1)报告编号。

(2)样本编号。

(3)送检单位/人。

(4)检测日期。

(5)检测人。

(6)动物基本信息（如品种、年龄、性别等，若提供）。

2.**检测项目**：明确列出本次检测的项目（如粪便寄生虫检测、血液原虫检测、体表寄生虫检查等）。

3.**检测结果**：

(1)**阳性结果**：

-清晰列出检出的寄生虫种类。

-描述虫体形态特征（如有必要）。

-如有计数，提供具体数量或感染强度指标（如EPG、感染率等）。

-可附上典型显微镜图像。

(2)**阴性结果**：明确记录“未检出目标寄生虫”。

(3)**未检测到**：明确记录“未检测到样本”或“未发现相关寄生虫”。

4.**结果解释（可选）**：简要说明结果可能的意义（如“轻度感染”、“中度感染”），但避免做出诊断或治疗建议。

5.**备注（可选）**：记录检测过程中遇到的特殊情况（如样本不合格、操作问题等）。

（二）异常处理与反馈**

1.**结果可疑或异常**