《脂质体脂膜结构的测定 x射线小角散射检测法》

Q/LB.□XXXXX-XXXX脂质体脂膜结构的测定X射线小角散射检测法范围本文件规定了利用X射线小角散射技术测定脂质体的脂质双分子层及其修饰磷脂层的厚度与分布的方法。本文件适用于脂膜特征结构在纳米尺寸范围内的各向同性的稀疏样品体系，主要包括包载药物等成分的脂质体溶液样品。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T13221纳米粉末粒度分布的测定X射线小角散射法GB/T38944无损检测中子小角散射检测方法ISO17867粒度分析-X射线小角散射方法(Particlesizeanalysis-SmallangleX-rayscattering(SAXS))ISO20804X射线小角散射方法测量多孔及颗粒体系内比表面积(Determinationofthespecificsurfaceareaofporousandparticulatesystemsbysmall-angleX-rayscattering)ISO23484X射线小角散射方法测量粒子浓度(Determinationofparticleconcentrationbysmall-angleX-rayscattering)ISO26824颗粒体系的粒子表征-术语(Particlecharacterizationofparticulatesystems–Vocabulary)术语和定义ISO26824界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1脂质体liposome由脂质双分子层形成的微小囊泡。3.2稀疏体系dilutesystem所包含的待测粒子浓度低，粒子间相互作用可以忽略不计的体系。符号本文件使用的符号如表1所示。表1符号含义及单位符号含义单位q散射矢量的大小nm-1I(q)散射强度-T透射率-P(q)形状因子-F(q)散射振幅-ρ(z)电子密度分布-方法原理X射线小角散射是由样品中电子密度不均匀性分布所引起的、位于入射X射线束附近（通常小于5°）的散射现象。对于溶液样品而言，其散射图像源于X射线照射到的所有溶剂和溶质分子散射信号的叠加。因此，为得到脂质体粒子的散射强度，需从总散射强度中扣除溶剂等本底散射强度。在稀疏样品体系中，粒子间的相互作用忽略不计，脂质体粒子的散射强度直接反映了其内部结构特征。因此，可以通过结构模型拟合计算得到脂质双分子层及其修饰磷脂层的厚度和分布等参数。试样的制备和要求浓度要求脂质体样品浓度过低会导致散射信号太弱，而浓度过高可涉及粒子间的相互作用，影响数据分析。样品制备时宜通过建立浓度梯度确定散射强度与浓度的依赖关系。分散性要求样品制备宜保证其均一性或单分散性，如采用特定孔径的聚碳酸酯膜挤出。辅助性测试要求宜结合动态光散射、透射电镜等表征技术确定样品的尺寸、形貌等基本特征，辅助X射线小角散射技术进行结构模型的建立。对于包载药物等成分的脂质体样品，宜同时制备其未包载的空白脂质体作为检测对照组。检测系统和装置检测系统X射线小角散射检测系统应包括光源、准直系统、真空系统、样品台、探测器等，可选用实验室X射线小角散射仪或同步辐射X射线小角散射线站进行检测。前者通常采用金属靶产生X射线，后者则依托更高强度的同步辐射X射线光源。样品池装置样品池应满足X射线散射的光路要求，如自身不能产生明显的散射信号、X射线透过率高等。通常可以将样品注入薄壁毛细管（如外径为1mm，壁厚为0.01mm的石英玻璃毛细管）内进行检测。宜选择便于重复使用的样品池装置，以避免因样品池间差异所造成的本底散射扣减的不准确。检测区间及校正在检测之前，应根据脂质体脂膜结构的尺寸范围对所需的散射矢量区间按照公式（1）进行估算， q=2πd (式中：d——样品的目标结构尺寸，单位为纳米（nm）。估算出所需要的散射矢量检测区间后，即可在一定的入射X射线波长条件下，通过改变样品到探测器距离来调节实际的检测范围。应选择校准样品（如山嵛酸银粉末）对当前检测条件下的散射矢量进行标定。检测步骤步骤一将样品池装置固定在样品台上，调整样品池中心与X射线光路位置一致。步骤二将样品注入样品池中。根据样品对X射线的吸收情况以及散射信号接收探测器的灵敏度和饱和度，选择合理的曝光时间。若采用同步辐射X射线光源测试，曝光时间宜设置为1s～100s；采用金属靶X射线源测试，曝光时间宜设置为30min～60min。步骤三开始测试样品，保存及记录样品的散射图像以及光强度计数。应进行多次曝光测试，取平均值以提高散射数据信噪比。步骤四清洗样品池后，将与样品相匹配的缓冲溶剂注入样品池中。测试过程中的光路状态、曝光时间等应与样品的测试条件保持一致。步骤五清洗样品池后，从步骤二开始测试下一个样品。检测数据分析步骤一利用软件标出探测器损坏及无效的像素单元（例如不能正常感光、束流阻挡器位置处的像素单元等），并在后续计算过程中忽略该单元的数据。步骤二脂质体溶液样品为各向同性体系，无需选取特定方向，全探测器的数据均可用于径向平均转化为一维散射强度数据。注：绝对散射强度校正非本标准数据分析必要步骤，如有需要，可参考ISO20804-2022执行。步骤三按公式（2）对样品吸收、本底进行校正，得到修正后的散射强度， Imeasq=Isq式中：Imeasq——实验测得的IsqIbqTsTb透射率由光强度计数比值计算而得。步骤四宜根据检测样品的脂膜特征信息（如双分子层层数等），选择合适的结构模型以及尺寸分布函数进行散射强度曲线拟合。注：附录A示出了一种脂膜多层结构模型及其表达式。步骤五基于公式（3）进行优化搜索，定量解析出脂质体的脂质双分子层及其修饰磷脂层的厚度等参数。简化的卡方值χr2 χr2=1N−式中：Imeasq——通过公式（2）修正后的散射强度；ImodelqN——数据点个数；M——拟合参数个数；∆Ii——数据点的索引。检测数据分析结果拟合结果的曲线表示宜采用实验散射强度与模型拟合散射强度的对比关系图表达，横坐标为散射矢量，纵坐标为散射强度，如图1所示。图1实验散射强度与模型拟合散射强度对比相关参数表示可根据需要，采取表格形式展示拟合参数、结构参数等。误差分析主要包含散射强度数据转化时的统计误差、数据处理过程中的误差传递等。检测报告检测报告应至少包括以下内容：仪器设备的型号；测试条件；样品信息；所依据的分析方法文件及其编号，如标准名称及编号等；分析结果；检测人员及日期等。

附录A（资料性）一种脂膜多层结构模型根据溶液散射理论，在稀疏溶液体系中可以忽略粒子间的相互作用，那么完成本底校正后的粒子散射强度Iq可近似为其形状因子Pq，即将散射振幅的平方F( Pq=F(以单层脂质体为例，如果忽略脂质体整体形貌及尺寸对散射数据的影响，只关注脂膜结构特征，那么可以在一定的散射矢量范围内，选择如下脂膜多层结构模型进行结构拟合计算。图A.1一种脂膜多层结构模型示意图在该模型中，平行于膜层的同一平面内的电子密度均一，但是在每个膜层内，沿垂直于脂膜平面方向上的电子密度分布函数为高斯函数，用公式（A.2）表示： ρz=式中：z——沿平面结构的法线方向的坐标位置；ρz——单个脂质体在zi——片层结构模型中各膜层所在的层数；ρiexp−ρi——第iεi——电子密度为ρσi——第i层膜层的电子密度分布标准差。对公式（A.2）电子密度分布函数进行傅立叶变换并进行取向平均后，得到该结构模型的形状因子，用公式（A.3）表示： Pq=q−2通过上述计算模型，拟合实验测得的散射数据与理论散射曲线，使得两者尽可能接近。进一步地，通过此优化求解后的电子密度分布情况，可以得到脂质体脂质双分子层及其修饰磷脂层的厚度与分布特征。各膜层厚度的定义可参考现有技术，根据实际情况进行说明并体现在报告中，如定义膜层的边界位置为该层电子密度衰减至最大值的10%位置处。

参考文献[1]国家药品监督管理局药品审评中心，纳米药物质量控制研究技术指导原则（试行），2021年[2]国家药品监督管理局药品审评中心，脂质体药物质量控制技术研究指导原则，2023年[3]O.Glatter,O.Kratky.SmallangleX-rayscattering.AcademicPress,London,1982.[4]M.H.J.Koch,P.Vachette,D.I.Svergun.Small-anglescattering:aviewontheproperties,structuresandstructuralchangesofbiologicalmacromoleculesinsolution.Q.Rev.Biophys.2003,36,147–227.[5]M.R.Brzustowicz,A.T.Brunger.X-rayscatteringfromunilamellarlipidvesicles.J.Appl.Crystallogr.2005,38,126-131.[6]Y.Schilt,T.Berman,X.Wei,Y.Barenholz,U.Raviv.UsingsolutionX-rayscatteringtodeterminethehigh-resolutionstructureandmorphologyofPEGylatedliposomaldoxorubicinnanodrugs.Biochim.Biophys.Acta.Gen.Subj.2016,1860,108-119.[7]Y.W.Li,J.Q.Zhang,P.Q.Song,X.R.Miao,G.F.Liu,C.M.Yang,X.H.Wei,N.Li,F.G.Bian.Small-angleX-rayscatteringforPEGylatedliposomaldoxorubicindrugs:ananalyticalmodelcomparisonstudy.Mol.Pharmaceutics.2023,20,4654-4663.《脂质体脂膜结构的测定X射线小角散射检测法》（征求意见稿）编制说明标准起草工作简况任务来源根据《上海市标准化协会关于下达2023年度第二批团体标准制修订项目计划的通知》（沪标协〔2023〕9号），上海市标准化协会下达了编制“脂质体脂膜结构的测定X射线小角散射检测法”的项目计划，由中国科学院上海高等研究院承担该标准的制定工作。目的与意义脂质体是由磷脂或类磷脂分子自组装形成的、具有双分子层结构的纳米囊泡。因其具有体内可降解、低免疫原性以及增加难溶性药物溶解度等优越性能，脂质体在药物递送、基因治疗、功效性护肤品等方面有着广泛的应用。我国对脂质体递送体系的研究起步相对较晚，但发展迅速，已有越来越多的企业及研发单位致力于脂质体纳米制剂的研究及工业化生产。对于脂质体药物，理解其处方和工艺制备方法所形成的特定结构，以及结构与药物疗效之间的构效关系是脂质体药物研发及产品质量控制的关键问题。例如，脂质膜结构的差异会影响药物的装载率、体内滞留时间以及药物释放速率。因此，在脂质体药物的特性分析和质量研究中，除了常规的检验分析方法外，还需要结合先进的分析技术，对脂质体药物的微观结构及其稳定性进行深入探究。X射线小角散射（SAXS）技术是一种表征物质微观结构的有效手段，可从纳米到微米尺度范围内获取样品全局结构参数和形状信息。利用SAXS技术可以定量表征脂质体的脂膜结构，得到脂质双分子层及其修饰磷脂层的厚度与分布。虽然SAXS技术暂未收载入各国药典中，但近年来随着新型纳米药物特性分析研究的不断深入，在国家药品监督管理局药品评审中心发布的多个纳米药物产品研究技术指南中，均推荐及鼓励生产企业采用SAXS方法进行产品相关理化性质表征及质量控制研究。应用SAXS技术可以获得样品体系内结构特征的统计平均值，测量结果具有相当的准确性、可靠性及稳定性。在研究和工业应用方面，国际标准化组织已发布了多个SAXS相关国际标准，内容涉及粒度分布与浓度检测等，但仍缺乏基于SAXS技术的脂质纳米药物结构检测方面的标准。国内外针对脂质体脂膜结构测定的标准化的X射线小角散射检测方法仍未建立，因此，亟需将该测试方法形成标准化的规范性文件，以确保检测结果的可重复性和再现性。这对于脂质体产品，特别是脂质体药物的研发与质量标准的建立，具有十分重要的意义。起草单位、起草人起草单位和参与单位本标准起草单位为中国科学院上海高等研究院。本标准协作单位包括：上海交通大学、中国科学院长春应用化学研究所、上海师范大学、西南科技大学、中石化（北京）化工研究院有限公司、国家药品监督管理局疫苗及生物制品质量监测与评价重点实验室、上海药品评审核查中心、赛诺普（苏州）科学仪器有限公司、安徽国科仪器科技有限公司、花安堂生物科技集团有限公司。主要起草人及其所作工作如下：主要起草人有李怡雯、李娜、刘广峰、宋攀奇、张建桥、李秀宏、滑文强、魏晓慧、门永锋、邹爱华、田强、唐毓婧、陆家海、叶宇翔、周一萌、宋良益、程薇、卢永杰。起草人员负责方法制定工作的组织、协调，相关资料的查询、收集，试验方法的确定、验证，标准文本及编制说明的撰写、修改。表1主要工作成员所负责的工作情况起草人工作职责李怡雯负责标准的编写、检测方法技术方案确定李娜负责标准的工作指导、组织协调刘广峰、宋攀奇、张建桥负责技术方案优化、验证数据的收集魏晓慧、卢永杰负责样品前处理条件的优化李秀宏、门永锋、邹爱华、田强、唐毓婧、陆家海、叶宇翔、周一萌负责标准的工作指导、标准规范化把关滑文强、宋良益、程薇负责方法验证主要工作过程（1）标准编制项目于2023年8月获得立项，成立标准编制工作组。（2）2023年9月至2023年10月，根据标准的立项建议，标准编制工作组查阅相关标准、文献等资料，在深入讨论基础上，形成了该标准检测方法技术方案。（3）2023年11月至2024年3月，标准编制工作组按照项目拟定的技术方案，对样品的前处理条件、检测系统条件等进行了优化试验工作。在国家蛋白科学研究（上海）设施BL19U2生物X射线小角散射线站上，使用符合本标准的技术方法，实现了脂质体脂膜结构的检测。（4）2024年4月至2024年6月，开展了检测方法的实验室间协同验证试验，由国家蛋白质科学研究（上海）设施BL19U2生物X射线小角散射光束线站、上海光源BL16B1X射线小角散射光束线站、赛诺普（苏州）科学仪器有限公司、安徽国科仪器科技有限公司4家单位/实验装置对该方法进行了验证。根据验证结果和建议，对本标准检测方法进行完善。（5）2024年7月至2024年8月，标准编制工作组完成标准的征求意见稿和编制说明，并提交给上海市标准化协会。标准编制原则和确定标准主要内容的依据标准的编制原则本标准按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草，主要遵循以下原则：（1）建立的标准分析方法具有科学性、先进性和可操作性，易于推广使用；（2）标准内容符合国家法律、法规的有关要求，未与已有标准冲突。确定标准主要内容的依据本标准规定了利用X射线小角散射技术测定脂质体的脂膜结构，包括脂质双分子层及其修饰层的厚度与分布。在按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》要求的基础上，同时参考GB/T20001.4-2015《标准编写规则第4部分：试验方法标准》的有关要求，确定了本标准的主要内容应包括以下11个部分：范围、规范性引用文件、术语和定义、符号、方法原理、试样的制备和要求、检测系统和装置、检测步骤、检测数据分析、检测数据分析结果、检测报告。方法的验证情况基本情况为确保本标准的适用性、一致性、规范性和可操作性，标准起草工作小组组织了4个实验室/单位，包括国家蛋白质科学研究（上海）设施、上海光源、赛诺普（苏州）科学仪器有限公司、安徽国科仪器科技有限公司，利用多台同步辐射X射线小角散射装置和实验室X射线小角散射仪对脂质体样品进行了方法验证。验证情况-1：国家蛋白质科学研究（上海）设施BL19U2生物X射线小角散射线站基本情况国家蛋白质科学研究（上海）设施BL19U2生物X射线小角散射线站完成本标准中检测系统条件的优化、分析方法的实现和检测方法的验证,所使用的样品及检测系统信息如下：测试样品包括：盐酸多柔比星脂质体上市药物Caelyx（产品批号：KHZUQ01）;相匹配的缓冲溶剂（含10%蔗糖与组氨酸）;与Caelyx成膜配方及制备方法相一致的空白脂质体；山嵛酸银粉末（校准样品）。光源类型：同步辐射X射线光源实验选取X射线波长：0.103nmX射线通量：1.0×1012photon∙s-1样品到探测器距离：2667mm探测器型号：Pilatus2M(Dectris)样品池：石英玻璃毛细管，外径1.0mm，壁厚0.01mm曝光时间：1s曝光次数：20验证过程及结果根据标准文件描述的试样制备的浓度要求，对Caelyx测试样品进行浓度梯度检测后，排除了该样品原始浓度下粒子间的相互作用影响。根据标准文件描述的辅助性测试要求，采用动态光散射方法表征了Caelyx测试样品的粒径大小为90.3±1.5nm,多分散性指数为0.05±0.02。结合冷冻透射电镜技术表征了Caelyx测试样品的形貌，具体为单层脂质体，其内水相包封了药物晶体。根据标准文件描述检测系统与装置要求，完成了X射线散射的光路优化以及散射矢量的校准。根据标准文件描述检测步骤，完成测试样品的散射数据采集。图1检测步骤流程图（左）和测试样品散射图像（右）根据标准文件描述检测数据分析步骤，完成测试样品散射图像中无效像素单元的剔除、一维散射强度数据转化、散射本底扣减等，得到脂质体粒子的散射强度曲线。参考标准文件附录A，选择一种脂膜多层结构模型，其电子密度分布函数为高斯函数表示。根据样品结构特点，构建的多层结构依次为偶联于脂质体脂质双分子层内表面的PEG修饰层、脂质体脂质双分子层的内层亲水头部、脂质体脂质双分子层的疏水尾部、脂质体脂质双分子层的外层亲水头部、偶联于脂质体脂质双分子层外表面的PEG修饰层。冷冻透射电镜的表征结果显示，该脂质体内水相所包封的药物以束状结构的纳米晶体沉淀形式存在。因此，可在脂膜多层结构模型基础上，另外构建圆柱体形貌的药物模型，根据标准文件描述的检测数据分析步骤五，进行拟合优化求解，使得脂质体粒子的实测散射强度与利用模型计算的理论散射强度之差总和最小。通过此优化求解后的脂膜电子密度分布情况，参考现有技术，定义不同膜层的边界位置为该层电子密度衰减至最大值的10%位置处，得到测试样品的脂质双分子及其PEG修饰层的厚度与分布特征。图2测试样品的实验散射强度及模型拟合散射强度曲线图表2测试样品结构参数3.3验证情况-2：上海光源BL16B1X射线小角散射光束线站3.3.1基本情况上海光源BL16B1X射线小角散射线站完成本标准中检测方法的验证,所使用的样品及检测系统信息如下：测试样品包括：盐酸多柔比星脂质体上市药物Caelyx（产品批号：KHZUQ01）;相匹配的缓冲溶剂（含10%蔗糖与组氨酸）;与Caelyx成膜配方及制备方法相一致的空白脂质体；山嵛酸银粉末（校准样品）。光源类型：同步辐射X射线光源实验选取X射线波长：0.124nmX射线通量：2.0×1011photon∙s-1样品到探测器距离：1900mm探测器型号：Pilatus2M(Dectris)样品池：石英玻璃毛细管，外径1.5mm，壁厚0.01mm曝光时间：60s曝光次数：33.3.2验证过程及结果根据标准文件描述检测系统与装置要求，完成了X射线散射的光路优化以及散射矢量的校准。根据标准文件描述检测步骤，完成测试样品的散射数据采集。根据标准文件描述检测数据分析步骤，完成测试样品散射图像中无效像素单元的剔除、一维散射强度数据转化、散射本底扣减等，得到脂质体粒子的散射强度曲线。参考标准文件附录A，选择一种脂膜多层结构模型，并构建圆柱体形貌的内部包载药物模型，根据标准文件描述的检测数据分析步骤五，进行拟合优化求解，使得脂质体粒子的实测散射强度与利用模型计算的理论散射强度之差总和最小。通过此优化求解后的脂膜电子密度分布情况，参考现有技术，定义不同膜层的边界位置为该层电子密度衰减至最大值的10%位置处，得到测试样品的脂质双分子及其PEG修饰层的厚度与分布特征。图3测试样品的实验散射强度及模型拟合散射强度曲线图表3测试样品结构参数3.4验证情况-3：赛诺普（苏州）科学仪器有限公司3.4.1基本情况赛诺普（苏州）科学仪器有限公司完成本标准中检测方法的验证,所使用的样品及检测系统信息如下：测试样品包括：盐酸多柔比星脂质体上市药物Caelyx（产品批号：KHZUQ01）;相匹配的缓冲溶剂（含10%蔗糖与组氨酸）;与Caelyx成膜配方及制备方法相一致的空白脂质体；山嵛酸银粉末（校准样品）。光源类型：铜靶实验选取X射线波长：0.154nmX射线通量：2.0×107photon∙s-1样品到探测器距离：600mm探测器型号：Eiger2R1M(Dectris)样品池：石英玻璃毛细管，外径1.5mm，壁厚0.01mm曝光时间：60min曝光次数：33.4.2验证过程及结果根据标准文件描述检测系统与装置要求，完成了X射线散射的光路优化以及散射矢量的校准。根据标准文件描述检测步骤，完成测试样品的散射数据采集。根据标准文件描述检测数据分析步骤，完成测试样品散射图像中无效像素单元的剔除、一维散射强度数据转化、散射本底扣减等，得到脂质体粒子的散射强度曲线。参考标准文件附录A，选择一种脂膜多层结构模型，并构建圆柱体形貌的内部包载药物模型，根据标准文件描述的检测数据分析步骤五，进行拟合优化求解，使得脂质体粒子的实测散射强度与利用模型计算的理论散射强度之差总和最小。通过此优化求解后的脂膜电子密度分布情况，参考现有技术，定义不同膜层的边界位置为该层电子密度衰减至最大值的10%位置处，得到测试样品的脂质双分子及其PEG修饰层的厚度与分布特征。图4测试样品的实验散射强度及模型拟合散射强度曲线图

表4测试样品结构参数3.5验证情况-4：安徽国科仪器科技有限公司3.5.1基本情况安徽国科仪器科技有限公司完成本标准中检测方法的验证,所使用的样品及检测系统信息如下：测试样品包括：盐酸多柔比星脂质体上市药物Caelyx（产品批号：KHZUQ01）;相匹配的缓冲溶剂（含10%蔗糖与组氨酸）;与Caelyx成膜配方及制备方法相一致的空白脂质体；山嵛酸银粉末（校准样品）。光源类型：铜靶实验选取X射线波长：0.154nmX射线通量：2.0×107photon∙s-1样