DB15∕T 2907-2023 溶血性曼氏杆菌病诊断技术规范

ICS11.220

CCSB41

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T2907—2023

溶血性曼氏杆菌病诊断技术规范

Technicalspecificationforthediagnosisofmannheimiahaemolytica

2023-03-10发布2023-04-10实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T2907—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。

本文件起草单位：内蒙古大学、内蒙古蒙微生物科技有限公司、金宇保灵生物药品有限公司。

本文件主要起草人：王炜、王岩、赵丽霞、韩四娥、孟凯、胡薇。

I

DB15/T2907—2023

溶血性曼氏杆菌病诊断技术规范

1范围

本文件规定了溶血性曼氏杆菌病的临床诊断、细菌分离与鉴定、PCR检测和间接ELISA抗体检测等诊

断技术要求。

本文件适用于牛、羊饲养场(户)和动物疫病检疫、诊疗单位对牛、羊临床样本和分离培养物中溶血

性曼氏杆菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

GB/T14926.43-2001实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

Mh：溶血性曼氏杆菌（Mannheimiahaemolytica）

LKTA：白细胞毒素蛋白A（LeukotoxinA）

PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction）

DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

bp：碱基对（Basepair）

dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxyribonucleosidetriphosphates）

Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）

TSB：胰蛋白胨大豆肉汤（Trypticsoybroth）

PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebuffersolution）

ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzymelinkedimmunosorbentassay）

5临床诊断

流行病学

由溶血性曼氏杆菌引起的牛、羊呼吸道疾病，一年四季均可发生，秋冬季多见。

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DB15/T2907—2023

临床症状

发病牛、羊主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、流涕，并伴有体温升高40℃～42℃、精神沉郁、

厌食等。发病初期动物呼吸速率加快，继而出现严重的呼吸困难，呼吸伴有啰音。

病理变化

临床病理变化以纤维素性渗出性肺炎、大叶性肺炎和胸膜肺炎为主。病理剖检可见：病变肺呈肉样

变、质地坚实、肺水肿、间质增宽、胸腔脏层和壁层均有纤维素附着、胸腔积液呈黄色或红黄色、肺与

胸膜黏连，心包炎。

6样品采集

主要试剂耗材与器械

除另有规定外，所用试剂均为分析纯。试验用水均符合GB/T6682-2008二级水规定。

TSB培养基（配制方法见附录A.1）、0.01mol/LPBS溶液（配制方法见附录A.2）、75%酒精、无菌

采样袋、5mL冻存管、2mL冻存管、手术剪刀、镊子。

病料采集

6.2.1将棉签伸入鼻腔或咽部刮取分泌物，所有拭子采完后分别放入盛有3mLTSB培养基的5mL冻

存管中，编号，记录。采集的样品密封后，于2℃～8℃条件下保存并送到实验室。

6.2.2将发病牛、羊剖检后取肺和淋巴结组织，编号，记录。采集的样品密封后，于2℃～8℃条件

下保存并送到实验室。

6.2.3采用75%酒精对采血动物颈部静脉表面皮肤进行擦拭消毒，采集2mL～5mL血液，按常规方法

分离血清，编号，记录，于2℃～8℃条件下保存并送到实验室。

7细菌分离与鉴定

试剂耗材

绵羊血琼脂平板（配制方法见附录A.3）、革兰氏染色液、瑞氏染色液、生化鉴定管、细菌培养皿。

仪器

高压灭菌锅、恒温培养箱、光学显微镜、生物安全柜、组织匀浆器或研磨器。

样品处理

7.3.1将6.2.1中鼻拭子、咽拭子中的棉签反复挤压后取出，将鼻拭子液、咽拭子液分装到2mL灭菌

的冻存管中。贴标签于-80℃冰箱保存。

7.3.2将组织样品分解成2×2×3cm大小组织块，然后用无菌剪刀剪碎后，加入5mL保存液，研磨

成组织悬液，分装到2mL灭菌的冻存管中。贴标签于-80℃冰箱保存。

细菌分离

7.4.1在无菌条件下，将按一定比例稀释的鼻拭子液、咽拭子液或发病牛羊的肺组织材料接种TSB培

养基中，置恒温摇床37℃、120r/min培养12h～16h后划线接种于绵羊血琼脂平板中，37℃培养

24h，使之形成菌落，以供纯化鉴定用。

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7.4.2取7.4.1中培养的圆形、光滑、湿润并伴有溶血现象的菌落，在绵羊血琼脂平板上进行划线纯

培养，37℃培养24h后，出现上述菌落（参见附录B中图B.1）。

染色镜检

7.5.1革兰氏染色

按照GB/T14926.43-2001中3.1进行操作，可见革兰氏阴性短杆菌或球杆菌（参见附录B中图B.2）。

7.5.2瑞氏染色

取病变组织的新鲜切面制备组织触片或抹片，滴加瑞氏染色A液3～5滴，固定1min；滴加瑞氏染色

B液3～5滴，轻轻晃动玻片，静置染色3min～5min；用蒸馏水冲洗，自然干燥后镜检，可见两极着色

的短杆菌或球杆菌（参见附录B中图B.3）。

生化鉴定

根据《伯杰细菌鉴定手册》溶血性曼氏杆菌生化鉴定项目，采用相应商品化生化鉴定管进行操作和

判定。溶血性曼氏杆菌可发酵麦芽糖、木糖、甘露醇和山梨醇，不发酵海藻糖，靛基质试验和脲酶试验

阴性。

8PCR检测

试剂耗材

细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖（电泳级）、DNA分子量标记DL2000、阴性对照：灭菌超纯水、

阳性对照：灭活的溶血性曼氏杆菌参考菌株（CVCC4091）或gcp基因的阳性质粒（参见附录B.4）、PCR

扩增用上、下游引物序列（参见附录B中表B.1）、1.5mL离心管、0.2mLPCR薄壁管或八联管。

仪器

PCR扩增仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统。

细菌基因组DNA提取

将7.4.1中增菌培养后菌液或7.4.2中纯培养菌落用商品化试剂盒进行基因组DNA提取。提取方法按

试剂盒说明书进行。

PCR扩增

每次进行PCR扩增时，除检测样品外，均需设置阳性对照和阴性对照。

8.4.1PCR反应体系：2×PCR反应预混液12.5µL，模板DNA（空白对照用水代替）2µL，上下游引物

各0.5µL，ddH2O补足至25µL。

8.4.2PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸40s；30个

循环，72℃总延伸10min。

PCR产物电泳

用1×TAE电泳缓冲液配制成2%琼脂糖凝胶。取5µLPCR产物分别加入样品孔，同时在一加样孔中加

入DNA分子量标准（DL2000），以5V/cm恒压电泳，30min后采用凝胶成像系统判定核酸片段大小。

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DB15/T2907—2023

PCR结果判定

8.6.1阳性对照出现一条227bp大小的条带，且阴性对照不出现条带。

8.6.2在满足8.6.1的条件下，被检样品的PCR产物经电泳后出现一条227bp的条带判定为核酸阳

性（+）；被检样品的PCR产物经电泳后不出现227bp的条带判定为核酸阴性（-）（参见附录B中图

B.6）。

9间接ELISA抗体检测

试剂耗材

大肠杆菌表达的溶血性曼氏杆菌LKTA重组蛋白、辣根过氧化物酶标记的驴抗绵羊二抗、驴抗山羊二

抗、兔抗牛二抗、Mh阳性血清、Mh阴性血清、包被缓冲液（配制方法见附录A.4）、封闭缓冲液（配制

方法见附录A.5）、洗涤缓冲液（配制方法见附录A.6）、稀释缓冲液（配制方法见附录A.7）、TMB显色

液（配制方法见附录A.8）、终止液（配制方法见附录A.9）。

仪器

酶标仪、微量振荡器、恒温培养箱、洗板机。

检测步骤

9.3.1包被酶标板

Mh重组LKTA蛋白用包被缓冲液稀释至终浓度为0.5μg/mL，每孔100µL包被96孔酶标板，4℃包被

16h。用洗涤缓冲液洗板5次，每孔200µL，每次3min，洗涤结束后拍干。然后按200µL/孔的用量加

入封闭缓冲液，37℃封闭2h，用洗涤缓冲液洗板5次后拍干。

9.3.2ELISA操作步骤

9.3.2.1用稀释缓冲液按体积比1:200稀释待检血清、阳性血清和阴性血清；将稀释后血清按100µL/

孔加入反应板，每个样品两个重复，37℃孵育2h，洗板同9.3.1。

9.3.2.2每孔加入100µL的酶标抗体，37℃孵育45min，洗板同9.3.1。

9.3.2.3每孔加入100µL的TMB显色液，37℃避光孵育15min。

9.3.2.4每孔加入50µL终止液终止显色反应，使用酶标仪测定450nm波长处的OD值。

9.3.3试验成立条件

阳性对照OD450＞0.5，且阴性对照OD450＜0.2，试验结果有效；否则，应重新进行试验。

9.3.4结果判定

在试验成立的前提下，待检样品OD450＞0.2，则判定该待检样品为Mh抗体阳性；待检样品OD450≤0.2，

则判定该待检样品为Mh抗体阴性。

10综合判定

符合5临床特点的病例，判定为疑似Mh感染。

符合10.1，经7分离出溶血性曼氏杆菌，或经8检测出Mh核酸的，判为溶血性曼氏杆菌病。

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非免疫动物经9检测出抗体阳性，判为Mh感染。

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A

A

附录A

（规范性）

试剂的配制

A.1胰蛋白胨大豆肉汤培养基

胰蛋白胨17.0g

大豆蛋白胨3.0g

氯化钠5.0g

磷酸氢二钾2.5g

葡萄糖2.5g

pH7.3±0.2

准确称取胰蛋白胨大豆肉汤（TrypticSoyBroth,TSB）30g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，

分装于三角瓶，121℃高压灭菌15min，备用。

A.20.01mol/LPBS溶液

氯化钠8.0g

氯化钾0.2g

磷酸二氢钾0.24g

磷酸氢二钠3.65g

pH7.2

将上述试剂加入到800mL蒸馏水中溶解，加水定容至1000mL，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min，

室温保存备用。

A.3绵羊血琼脂平板

胰蛋白胨15.0g

大豆胨5.0g

氯化钠5.0g

琼脂15.0g

pH7.3±0.2

准确称取胰蛋白胨大豆琼脂（TrypticSoyAgar,TSA）40g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，

分装三角瓶，121℃高压灭菌15min，加入10%绵羊脱纤血充分混匀后倒平皿。

A.4包被缓冲液（0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液）

碳酸钠0.318g

碳酸氢钠0.588g

去离子水200mL

用0.22μm滤膜过滤除菌，室温保存备用。

A.5封闭缓冲液（含3%BSA的PBST）

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pH7.4PBS1000mL

吐温-200.5mL

BSA30g

现配现用。

A.6洗涤缓冲液—PBST

pH7.4PBS1000mL

吐温-200.5mL

现配现用。

A.7稀释缓冲液（含1%BSA的PBST）

pH7.4PBS1000mL

吐温-200.5mL

BSA10g

现配现用。

A.8TMB显色液

A.8.1底物液A

TMB（分析纯）200mg

无水乙醇或DMSO100mL

蒸馏水加至1000mL

A.8.2底物液B

磷酸氢二钠（分析纯）14.6g

柠檬酸（分析纯）9.33g

0.75%过氧化氢尿素6.4mL

蒸馏水加至1000mL，pH值调至5.0～5.4

A.8.3将底物液A和底物液B按1:1混合，即成底物显色液，现配现用。

A.9终止液

111mL分析纯浓硫酸缓慢逐滴加入889mL去离子水中，分装保存备用。

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B

B

附录B

（资料性）

溶血性曼氏杆菌分离鉴定

溶血性曼氏杆菌分离培养见图B.1。

图B.1溶血性曼氏杆菌接种平板

革兰氏染色见图B.2。

图B.2革兰氏染色结果

革兰氏染色结果

图B.3瑞氏染色结果