DB15∕T 2728-2022 牛轮状病毒腹泻诊断技术规范

ICS65.020.30

CCSB41

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T2728—2022

牛轮状病毒腹泻诊断技术规范

Technicalspecificationfordiagnosisofbovinerotavirusdiarrhea

2022-07-29发布2022-08-29实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T2728—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。

本文件起草单位：内蒙古农业大学、北京生泰尔科技股份有限公司、内蒙古自治区动物疫病预防控

制中心、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、金宇保灵生物药品有限公司。

本文件主要起草人：徐晓静、王建龙、谢梦圆、马立峰、郭宇、王秀敏、常继涛、陈坚、马培倩、

周伟光、黄海碧。

I

DB15/T2728—2022

牛轮状病毒腹泻诊断技术规范

1范围

本文件规定了牛轮状病毒腹泻的临床诊断和实验室诊断技术方法、操作程序和判定标准。

本文件适用于牛轮状病毒腹泻的诊断、监测和检疫等。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

BRV：牛轮状病毒（Bovineratovirus）

CPE：致细胞病变效应（CytopathicEffect）

DMEM：达尔伯克改良依格尔培养基（DuLbecco’sModifiedEagleMedium）

FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）

MA104细胞：恒河猴肾细胞（Rhesuskidneycell）

PBS：磷酸盐缓冲盐水（PhosphateBufferSaline）

PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

TCID50：半数组织培养物感染量（MedianTissueCultureInfectiveDose）

5生物安全措施

样品处理的生物安全措施符合GB19489的规定。

样品采集的生物安全措施符合GB/T27401的规定。

6病原

牛轮状病毒属于呼肠孤病毒科，轮状病毒属，病毒颗粒无囊膜，近似球形，直径约70nm～75nm，

具有外、中、内三层衣壳，每层均为20面体对称。基因组为线状双股RNA。

1

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7临床诊断

流行病学

7.1.1易感动物

不同年龄和品种牛均可感染BRV，3周龄内牛最易感，多发生于1周龄内的犊牛。

7.1.2传染源

病牛和带毒牛是本病自然流行的传染源，隐性感染牛和痊愈牛可持续排毒。

7.1.3传播途径

消化道是主要的传播途径。

7.1.4流行特点

有明显季节性，多发生在晚秋、冬季和早春。

临床症状

犊牛感染后在12h～24h出现严重腹泻，发病突然，病初表现为精神不振、厌食、呕吐和腹泻，体

温正常或略高，排黄白色液状粪便，有时排出带有黏液的稀便。病程长者脱水明显，严重者常有死亡。

成年牛多呈隐性感染，并在一定时间持续向外界排毒。

病理变化

牛轮状病毒感染病理变化主要表现在消化道，肠腔内充满凝乳块和乳汁，小肠肠壁变薄、半透明，

肠内容物呈液状、灰黄或灰黑色。

结果判定

符合6.1、6.2、6.3，可判定为牛轮状病毒腹泻疑似病例。

8实验室诊断

主要仪器设备

电镜、低温高速离心机、倒置显微镜、T25细胞培养瓶、CO2细胞培养箱、96孔细胞培养板、PCR仪、

PCR管、电泳仪、凝胶成像仪、酶标仪。

主要试剂

PBS、2%磷钨酸、DMEM培养基、细胞培养液、细胞维持液、胰酶、MA104细胞、PCRTaq酶、DNAMarker、

TAE电泳缓冲液。主要试剂配制见附录A。

样品采集与处理

8.3.1粪便样品

将棉拭子伸入肛门内刮取新鲜粪便，也可无菌采集地上刚排出的新鲜粪便。分别放入装有3mLPBS

的采样管中，编号并记录相关信息。

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漩涡振荡器充分振荡后，12000r/min4℃离心5min～8min，取上清编号备用。

8.3.2组织样品

取病死牛小肠及内容物，置于无菌密封袋或采样杯内。

称取1g样品置于研钵，充分研磨后加5mLPBS，混匀，8000r/min4℃离心5min，取上清编号

备用。

8.3.3血液样品

一次性采血管采集血液3mL～4mL，犊牛采用颈静脉采血，成年牛采用尾静脉采血。

室温静置30min，3000r/min～4000r/min离心5min～10min。分离血清编号备用。

样品运输与保存

采集的样品应低温运送，尽量12h内运送至实验室。

采集或处理后的样品在2℃～8℃保存，一般不超过24h，若长期保存，应置于-70℃以下条件保

存。

病原学检测

8.5.1电镜检查

将采集的粪便或肠内容物用PBS制成1:4悬液，于盛有玻璃珠的管内充分震荡30min，取悬液3000

r/min离心30min，取上清，15000r/min离心30min，取上清，以40000r/min～50000r/min离心3

h～4h，弃上清，加1～2滴蒸馏水悬浮，滴加铜网，2%磷钨酸染色，电镜下观察病毒粒子形态。

8.5.2病毒分离鉴定

8.5.2.1病毒分离

8.5.2.1.1单层细胞制备

MA104细胞可用于牛轮状病毒分离培养。

用胰酶消化细胞，加入至少等体积的细胞培养液终止，吹打混匀，使其分散浓度为1～2×106个/毫

升，分装到T25细胞培养瓶，置于5%CO2培养箱中37℃静置培养24h～48h。随时观察细胞生长情况，

待细胞长成单层备用。

8.5.2.1.2接种细胞

将处理后的样品用细胞维持液制成1:5悬液，漩涡振荡混匀，3000r/min4℃离心10min，用0.22

µm滤膜过滤后取上清，添加浓度为10µg/mL～20µg/mL胰酶，37℃处理0.5h～1h。每份样品接种3瓶

细胞，设置正常细胞对照组。接种前弃去细胞培养瓶中液体，按细胞维持液终体积的10%加入处理好的

样品，37℃吸附1h，期间每隔20min摇晃一次，吸附完成后补加含0.5µg/mL～2µg/mL胰酶的细胞

维持液。对照组不接种样品，弃去培养液后加入等量细胞维持液。均置于5%CO2培养箱中37℃静置培

养。

8.5.2.1.3观察和记录

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每天观察细胞状态并记录，连续观察4d～5d。如对照组细胞单层完好，细胞生长正常，接种样品

的细胞出现CPE，且80%以上细胞出现时，置-70℃以下冻存。若接种的细胞无CPE出现，反复冻融3次，

进行盲传。

8.5.2.1.4盲传

将第1代无CPE的细胞培养物冻融3次后混合，5000r/min4℃离心5min～8min，取上清继续

接种细胞，进行观察、记录、收毒，盲传第2代。此过程中培养物仍无CPE则按同样的方法继续盲传至

第5～7代，若出现CPE，达到80%以上时收毒，置-70℃以下冻存。

8.5.2.2中和试验（固定血清-稀释病毒法）

8.5.2.2.1单层细胞制备

将细胞浓度制备为1～2×106个/mL，于96孔板培养，每孔100µL，加细胞培养液补齐至1毫升/孔，

置于5%CO2培养箱37℃培养24h。

8.5.2.2.2固定血清-稀释病毒法

用DMEM培养基将病毒液进行梯度稀释（10-1～10-8）；将不同稀释梯度的病毒液和已灭活的待检血

清等量混合，37℃水浴感作1h；取混合液200µL分别加至已长成单层细胞的96孔细胞培养板，每个稀

释梯度接种4孔；同时设对照非免疫血清（对照组）和正常细胞各4孔。于5%CO2培养箱37℃培养，计

算每组的TCID50和中和指数。

8.5.3PCR检测

8.5.3.1总RNA提取

将采集的样品或细胞培养物进行处理，按RNA提取试剂盒方法提取核酸。在-20℃条件下可短时间

保存，若需长期保存，应置于-70℃以下条件，避免反复冻融。

8.5.3.2引物合成

根据BRVVP6基因设计引物，采用常继涛文章“牛轮状病毒病原流行病学调查、基因重配毒株的构

建及二价减毒株的免疫原性评价”中BRV引物序列：BRV-VP6-F：GACGGAGCGACTACATGGT；BRV-VP6-R：

GTCCAATTCATACCTGGTGG。

8.5.3.3反应体系

按25µL反应体系配制。

一步法：模板2µL，上、下游引物各1µL，OnestepTaq酶12.5µL，RNase-FreeH2O8.5µL。

两步法：按反转录试剂盒反转为cDNA；模板2µL，上下游引物各1µL，Taq酶12.5µL，RNase-Free

H2O8.5µL。

8.5.3.4反应参数

一步法：50℃30min；94℃5min；95℃20s，54℃30s，72℃30s，35个循环；72℃

10min。

两步法：94℃5min；95℃20s，54℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。

8.5.3.5电泳检测

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制备琼脂糖凝胶，取5µL～8µLPCR扩增产物加入上样孔，同时加入阳性和阴性对照以及DNAMarker，

于1×TAE电泳缓冲液中进行电泳，凝胶成像仪观察结果。

8.5.3.6测序分析

PCR扩增产物经胶回收纯化后测序分析，于NCBI中Blast分析是否为牛轮状病毒VP6基因。

8.5.4ELISA检测

待检粪便样品按牛轮状病毒抗原诊断ELISA试剂盒方法进行检测。

8.5.5结果判定

8.5.5.1电镜检查结果

可见略呈球形，直径约70nm～75nm的病毒颗粒，其形态似典型的“车轮”状（见附录B），即判

定样品为牛轮状病毒阳性。

8.5.5.2中和试验结果

当正常对照组孔内细胞单层生长良好，证明试验成立；可根据Reed-Muench法计算中和指数（见附

录C），待检血清的中和指数大于50(Log＞1.7)，即可判定为阳性；10～49(Log=1～1.6)为可

疑；小于10(Log＜1)为阴性。

8.5.5.3PCR检测结果

阳性对照、PCR产物与预期片段大小一致（207bp），同时阴性对照无条带；即判定为阳性。

测序分析Blast比对为牛轮状病毒VP6基因，即判定为阳性。

8.5.5.4ELISA检测结果

按ELISA试剂盒要求进行判定，样品结果符合阳性标准即判定为阳性。

血清学检测

采用中和试验（固定病毒-稀释血清法）进行血清学检测。

8.6.1检测时间

发病初期和发病后2周各检测1次。

8.6.2血清稀释

于1.5mL离心管中加入DMEM培养基，每管100µL；取56℃，30min灭活的血清100µL加入管内，

从第一个管开始做10倍连续稀释，从最后一管内弃去100µL液体。

8.6.3感作

每个不同稀释度的血清内加入100µLBRV病毒液，充分混匀，37℃水浴感作1h。

8.6.4接种

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取200µL感作后的液体分别加至已长成单层细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释梯度接种4孔；同

时设血清毒性对照（细胞内加最低稀释度的血清）、1:10稀释的BRV阳性血清对照、1:5稀释的阴性血清

对照和正常细胞对照各4孔及BRV病毒液回归对照100～10-3的4个稀释度，每个稀释度各4孔。

8.6.5观察和记录

将细胞板置于5%CO2培养箱37℃培养，连续观察5d～7d，观察并记录各孔CPE。

8.6.6结果判定

当正常对照组孔内细胞单层生长良好，阳性血清对照组呈现预期的中和效价，阴性血清对照组没有

中和效价，证明试验成立。记录血清各稀释度的4个孔中出现CPE的孔数，按照Reed-Muench法（见附录

C）分别计算血清中和BRV的抗体效价，抗体效价大于1:5时，即为中和试验结果阳性。

发病初期和发病后2周中和试验结果均为阳性，且发病后2周抗体效价达发病初期的4倍，即判定为

牛轮状病毒感染。

9综合判定

疑似

符合6.1、6.2、6.3，可判定为牛轮状病毒腹泻疑似病例。

确诊

符合6.1、6.2、6.3，同时病原学检测中任一检测（电镜检查、病毒分离鉴定、PCR检测、ELISA检

测）结果为阳性可确诊牛轮状病毒腹泻。

符合6.1、6.2、6.3，同时符合7.6.6，可确诊牛轮状病毒腹泻。

6

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A

A

附录A

（规范性）

试剂配制

A.1PBS缓冲液：

NaCl8g

KCl0.2g

Na2HPO41.44g

KH2PO40.24g

蒸馏水定容至800mL，HCl调其pH至7.4左右，加蒸馏水定容至1000mL，121℃15min高压灭菌。

A.2细胞培养液：

DMEM培养基44.5mL

FBS5mL

青链霉素(10000U/mL)500µL

混合均匀后，4℃密封保存，建议现配现用。

A.3细胞维持液

DMEM培养基44.5mL

胰酶0.25g/mL

青链霉素(10000U/mL)500µL

混合均匀后，4℃密封保存，建议现配现用。

A.450×TAE电泳缓冲液

三羟甲基氨基甲烷（Tris）242g

EDTA-2Na37.2g

冰乙酸57.1mL

去离子水942.9mL

Tris和EDTA-2Na溶于800mL去离子水，搅拌均匀；加入冰乙酸，充分溶解；用1moL/LNaOH调pH值

至8.3，灭菌去离子水定容至1000mL后，室温保存。使用时稀释50倍即为1×TAE电泳缓冲液。

7

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B

B

附录B

（资料性）

牛轮状病毒电镜图

牛轮状病毒电镜检查结果如下图，镜下可见略呈球形，直径约70nm～75nm的病毒颗粒，其形态似

典型的“车轮”状。

图B.1牛轮状病毒粒子电镜图