大鼠实验技术操作规定

大鼠实验技术操作规定一、实验准备阶段

（一）实验动物准备

1.来源：选择健康、遗传背景明确、体重在180-250g之间的大鼠，来源应符合实验动物福利标准。

2.饲养环境：实验前需在SPF级屏障环境中饲养至少1周，温度（20±2）℃，湿度（50±10）%，12小时光照/黑暗循环。

3.饲养条件：自由摄食饮水，使用标准化饲料（如普通饲料或高脂饲料，根据实验需求选择）。

（二）实验器械与试剂准备

1.器械检查：确保手术器械（如手术剪、缝合针）、注射器（1mL、5mL）、固定板等清洁消毒合格。

2.试剂准备：如生理盐水、麻醉剂（如水合氯醛，剂量0.35-0.5mL/100g）、染料（如Evansblue）等需现配现用。

3.记录工具：准备电子记录仪、行为学评分表等。

二、实验操作规范

（一）麻醉操作

1.麻醉给药：腹腔注射麻醉剂，剂量需根据体重调整（如水合氯醛0.4mL/100g）。

2.麻醉监测：注射后30秒开始观察大鼠反应，确保呼吸平稳、角膜反射消失。

3.维持麻醉：术中可追加麻醉剂（如每60分钟追加1/3初始剂量）。

（二）手术操作（以心脏灌流为例）

1.手术流程：

(1)暴露胸腔：沿肋骨剪开皮肤及脂肪，剪开肋骨2-3根。

(2)心脏暴露：用无创夹固定心脏，暴露主动脉及左心室。

(3)灌流准备：连接灌流泵，先灌注生理盐水（37℃）冲洗血液，再灌注固定液（如4%多聚甲醛）。

2.注意事项：

(1)动作轻柔避免损伤心肌。

(2)灌流速度控制在10-15mL/min。

（三）行为学实验操作（以平衡测试为例）

1.测试步骤：

(1)训练阶段：每天重复训练5次，每次10分钟，使大鼠适应测试平台。

(2)测试记录：用摄像头记录大鼠在平台上的站立时间（如前肢离地时间），累计分析。

2.数据处理：剔除异常数据（如站立时间＞30秒视为失败）。

三、实验结束与标本处理

（一）实验终止

1.伦理审查：确保实验符合动物福利伦理要求，必要时实施安乐死（如过量麻醉）。

2.尸体处理：实验后尸体需进行无害化处理（如焚烧）。

（二）标本保存

1.心脏标本：固定后置于30%蔗糖溶液梯度脱水，再转入二甲苯透明，最后石蜡包埋。

2.数据归档：实验记录需双人核对，电子版与纸质版存档至少3年。

四、安全防护要点

（一）个人防护

1.必须穿戴实验服、手套、护目镜。

2.操作中避免皮肤接触化学试剂，如不慎接触需立即用大量清水冲洗。

（二）环境防护

1.实验台面需铺设防滑垫，防止器械滑落。

2.术后器械需立即灭菌，避免交叉污染。

五、异常情况处理

（一）麻醉意外

1.若大鼠呼吸停止，立即进行人工呼吸，并通知兽医。

2.调整麻醉剂量，避免下次实验重复发生。

（二）术后感染

1.观察伤口红肿、分泌物等情况，必要时使用抗生素（如青霉素）。

2.记录感染案例并分析原因，优化手术流程。

**一、实验准备阶段**

（一）实验动物准备

1.来源与接收：

(1)选择具备资质的实验动物供应商，确保大鼠来源符合卫生和遗传背景要求。

(2)接收时检查动物健康状况，包括活动能力、毛发光泽、无异常气味等。

(3)记录每只大鼠的个体信息（如编号、性别、出生日期、体重）于实验档案。

2.预饲与适应：

(1)接收后进行至少7天的预饲期，使用标准颗粒饲料和自由饮水。

(2)放置在安静、通风的适应饲养间，减少环境应激。

(3)每日观察动物行为、饮食饮水情况，并称重记录。

3.健康筛查：

(1)进行基础健康检查，包括外观检查（皮毛、眼睛、鼻子）、听诊（心肺）、称重。

(2)根据实验需求，可进行血清学或病原学检测（如病毒、细菌筛查）。

(3)拒绝患有明显疾病（如腹泻、皮疹、呼吸系统症状）的动物进入实验。

（二）实验器械与试剂准备

1.器械清洗与消毒：

(1)手术器械：包括手术剪、手术刀、组织镊、缝合针线等，需使用高压蒸汽灭菌（121℃，15-20分钟）或化学消毒剂（如75%乙醇浸泡30分钟）消毒。

(2)注射器：根据需要选择不同规格（如1mL、3mL、5mL），确保无菌，使用前用生理盐水冲洗。

(3)固定装置：如手术台固定板、鼠笼等，需清洁并用消毒剂擦拭。

2.试剂配制与检查：

(1)麻醉剂：按说明书精确配制水合氯醛溶液（如10g/L），使用前摇匀检查澄清度。

(2)缓冲液：配制生理盐水（0.9%NaCl）或特定缓冲液（如磷酸盐缓冲液PBS），使用前用滤膜（0.22μm）过滤除菌。

(3)固定液：如4%多聚甲醛溶液，需新鲜配制或使用商业预配产品，确保浓度准确。

3.实验环境准备：

(1)检查实验操作区域的洁净度，确保符合无菌操作要求。

(2)准备应急物品，如急救箱（含生理盐水、抗生素、消毒棉球等）。

(3)连接并测试所有仪器设备，如灌流泵、监测设备等。

**二、实验操作规范**

（一）麻醉操作

1.麻醉方式选择：

(1)常用腹腔注射麻醉（如水合氯醛、戊巴比妥钠）。

(2)根据实验需求选择合适麻醉深度（如浅麻醉用于简单操作，深麻醉用于手术）。

2.剂量计算与给药：

(1)剂量通常根据体重计算（如水合氯醛：0.35-0.5mL/100g体重）。

(2)使用无菌注射器进行腹腔注射，针头角度约45度，深度约1-1.5cm。

(3)给药后轻抚动物腹部，观察30-60秒进入麻醉状态（表现为呼吸减慢、对刺激无反应）。

3.麻醉深度监测：

(1)观察呼吸频率与深度、角膜反射、对疼痛刺激的反应（如尾巴提起）。

(2)必要时通过追加少量麻醉剂维持麻醉深度。

4.麻醉后护理：

(1)将动物置于保定盒内，头部抬高防止误吸。

(2)监测体温，必要时使用加温垫维持体温（如37±0.5℃）。

（二）手术操作（以心脏灌流固定为例）

1.手术前准备：

(1)复习手术流程，准备好所有器械和试剂。

(2)用酒精棉球消毒动物胸部毛发，范围至少覆盖心脏区域。

(3)铺设无菌手术巾，建立无菌操作区域。

2.手术步骤：

(1)切开皮肤与脂肪：沿肋骨走向做2-3cm切口，用止血钳分离皮下脂肪。

(2)暴露胸腔与心脏：剪开肋间肌（注意保护胸膜），用无齿镊牵引暴露心脏。

(3)插入灌流针：在左心室部位找到合适位置，用缝合针穿过心肌，插入灌流针。

(4)连接灌流系统：连接灌流泵、压力监测装置和灌流液袋。

(5)开始灌流：先以生理盐水（37℃）快速冲洗血液，观察心脏颜色变化。

(6)固定：生理盐水灌流结束后，立即切换至固定液（如4%多聚甲醛），缓慢匀速灌流。

3.术后处理：

(1)灌流结束后，取出灌流针，用缝合线结扎左心耳。

(2)沿心脏周围剪开右心房，继续缓慢灌流固定液。

(3)完成灌流后，取出心脏，置于固定液中过夜（4-6小时）。

（三）行为学实验操作（以平衡测试为例）

1.设备准备：

(1)准备平衡测试平台（如圆形玻璃板或金属网，直径约30cm，高度30cm）。

(2)配备计时器、行为记录本或摄像机。

(3)如需刺激物，提前准备好（如不同重量物体）。

2.动物训练：

(1)在正式测试前，每天训练动物5-10分钟，使其熟悉平台和环境。

(2)训练时给予少量奖励（如少量食物），避免产生过度恐惧。

(3)记录训练过程中的适应情况，如停留时间、跌落次数。

3.测试执行：

(1)测试前将动物置于平台边缘，记录其自主站立的时间（前肢完全离地）。

(2)可进行不同条件测试（如有无视觉线索、不同光照条件）。

(3)每次测试后给予安慰性互动，减少动物疲劳。

4.数据记录与分析：

(1)详细记录每次测试的站立时间、跌落方向、持续时间等。

(2)使用统一评分标准（如根据站立稳定性评分）。

(3)数据用统计学软件（如SPSS）进行整理分析。

**三、实验结束与标本处理**

（一）实验终止

1.安乐死操作：

(1)如需终止实验，使用humaneendpoints规定的安乐死方法（如过量麻醉）。

(2)操作需由经验丰富的实验人员执行，确保动物快速无痛死亡。

(3)记录安乐死时间及执行人员。

2.尸体处置：

(1)安乐死后的动物尸体需统一收集，进行无害化处理（如焚烧）。

(2)处置过程需符合实验室规定，避免环境污染。

(3)做好处置记录。

（二）标本保存与处理

1.心脏标本：

(1)灌流固定的心脏取出后，置于不同浓度梯度（如30%、50%、70%、80%、95%）的蔗糖溶液中脱水（每日更换溶液）。

(2)脱水后转入纯二甲苯透明（至少24小时更换一次）。

(3)最后注入石蜡，包埋制备石蜡切片。

2.组织切片：

(1)石蜡包埋后，使用切片机（切片厚5-10μm）制备连续切片。

(2)切片需编号，按顺序排列于载玻片上，标记清晰。

(3)可进行HE染色或其他特殊染色（如免疫组化），用于显微镜观察。

3.数据归档：

(1)实验原始记录（包括手术记录、行为学评分、图片等）需双人核对。

(2)电子数据与纸质记录共同存档，保存期限不少于3年。

**四、安全防护要点**

（一）个人防护

1.服装与手套：

(1)必须穿戴实验服、长裤、鞋套。

(2)操作化学试剂时佩戴丁腈手套，接触动物时佩戴乳胶手套。

(3)必要时佩戴护目镜或面罩。

2.化学品防护：

(1)了解所用试剂的MSDS（材料安全数据表），注意其危害性。

(2)使用移液管器时避免皮肤接触腐蚀性试剂（如固定液）。

(3)洗手液需专用，实验结束后必须彻底清洗双手。

（二）环境防护

1.操作区域：

(1)实验台面铺设防滑、易清洁的垫子。

(2)保持操作台整洁，器械分类放置，避免混淆。

(3)禁止在实验区域内饮食、吸烟。

2.器械管理：

(1)灭菌器械需检查灭菌效果（如使用生物指示剂）。

(2)注射器等接触动物体内的器械必须无菌，严禁复用。

(3)术后器械立即分类处理（可重复使用器械需彻底清洗消毒）。

**五、异常情况处理**

（一）麻醉意外

1.呼吸停止：

(1)立即停止给药，松开动物固定，清除口腔分泌物。

(2)尝试人工呼吸（如捏住鼻子，口对口吹气），并通知兽医。

(3)检查麻醉剂是否过量，下次实验谨慎调整剂量。

2.心率/呼吸骤停：

(1)立即进行心肺复苏（如胸外按压），同时联系兽医支援。

(2)保持呼吸道通畅，必要时使用辅助通气设备。

（二）手术并发症

1.大出血：

(1)立即压迫出血点，查找并结扎出血血管。

(2)如出血严重，需调整手术方案或终止手术。

(3)术后加强观察，必要时使用止血药物。

2.术后感染：

(1)观察伤口有无红肿、脓性分泌物、周围温度升高。

(2)如怀疑感染，采集