DB61-T 1815-2024 化妆品修护功效测试技术规范

ICS71.100.70CCSY42DB61TechnicalSpecificationforcosmeticsrepai陕西省市场监督管理局发布IDB61/T1815—2024前言 12规范性引用文件 13术语和定义 14基本要求 25测试准备 36测试 37数据分析 48测试报告 59质量保证 5附录A（资料性）图片处理方法 6DB61/T1815—2024本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由陕西省药品监督管理局提出并归口。本文件起草单位：陕西省食品药品检验研究院、陕西博溪通用检测科技有限公司、陕西省药品和疫苗检查中心、陕西省药品技术审评中心、咸阳市食品药品检验检测中心。本文件主要起草人：蔡虎、刘海静、冯润东、曹涵博、杨文娟、吴小勇、党琳琳、卢永波、李潇、王莉芳、罗阿利、张若冰、李晓春。本文件首次发布。本文件由陕西省食品药品检验研究院负责解释。联系信息如下：单位：陕西省食品药品检验研究院电话址：陕西省西安市高新区科技五路21号邮编：710065DB61/T1815—20241化妆品修护功效测试技术规范本文件规定了化妆品修护功效测试的基本要求、测试准备、测试、数据处理、测试报告和质量保证的要求。本文件适用于化妆品体外角质形成细胞迁移率的测试。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T622化学试剂盐酸GB/T646化学试剂氯化钾GB/T678化学试剂乙醇(无水乙醇)GB/T1263化学试剂十二水合磷酸氢二钠（磷酸氢二钠）GB/T1266化学试剂氯化钠GB/T1274化学试剂磷酸二氢钾GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T21395二甲基亚砜SN/T3899化妆品体外替代试验良好细胞培养和样品制备规范3术语和定义SN/T3899界定的以及下列术语及定义适用于本文件。3.1修护repair有助于维护施用部位保持正常状态。3.2细胞迁移cellmigration指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的刺激后而产生的移动。3.3细胞铺板率cellfusionrate细胞覆盖培养皿的面积占培养皿总表面积的百分比。DB61/T1815—202424基本要求4.1环境要求4.1.1与细胞相关的实验操作应在无菌环境下进行，洁净度应达到100级要求，环境温度应控制在20℃~24℃,环境湿度应控制在50%～70%，防震动，防电磁干扰。4.1.2其他试验操作应在常规实验室环境下进行，生物安全等级达到一级要求。4.2耗材和试剂4.2.1一般要求所用试剂应为分析纯，试验用水应按GB/T6682的要求进行制备。与细胞培养相关试剂、耗材应作无菌处理。4.3耗材耗材应满足下列要求：a)细胞培养瓶规格为25cm2、75cm2；b)细胞培养板为6孔平底细胞培养板；c)无菌离心管规格为1.5mL、15mL、50mL；d)移液器枪头为10μL、200μL、1000μL；e)过滤器孔径为0.22μm；f)直尺长度≥15cm。4.4试剂试剂应满足下列要求：a)二甲基亚砜应符合GB/T21395的要求；b)无水乙醇应符合GB/T678的要求；c)磷酸二氢钾（KH2PO4）应符合GB/T12745的要求；d)十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）应符合GB/T12635的要求；e)氯化钠（NaCl）应符合GB/T12665的要求；f)氯化钾（KCl应符合GB/T6465的要求；g)盐酸（HCl）应符合GB/T6225的要求；h)角质形成细胞培养基为无血清培养基；i)表皮细胞生长因子(EGF)纯度≥95%。4.5试剂配制试剂配制应满足以下要求：a)磷酸盐缓冲溶液（0.1M，pH7.4）：称定0.27g磷酸二氢钾、2.87g十二水合磷酸氢二钠、8.00g氯化钠和0.20g氯化钾加水800mL溶解，用盐酸调pH至7.4，并加水定容至1000mL，过滤除菌，冷藏保存，有效期14d；b)EGF溶液（1ng/mL）：称定10ngEGF标准品溶于10mL角质形成细胞培养基中，配置成1ng/mL过滤除菌，冷冻保存，有效期28d。4.6仪器设备DB61/T1815—20243仪器设备应符合以下要求：a)倒置显微镜放大倍数为100倍～400倍；b)细胞培养箱条件为37℃,5%CO2，95%相对湿度；c)分析天平精度为0.0001g；d)移液器量程为100μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL；e)超净工作台洁净度达到100级。5测试准备5.1细胞准备5.1.1应采用人源皮肤的原代角质形成细胞，以角质形成细胞培养基为基础培养液于细胞培养箱中培养。5.1.2测试前，宜取冷冻保存的角质形成细胞进行复苏培养，传代培养到P7代时，以2×105个细胞/孔的密度接种到6孔细胞培养板中，每个试验组准备3个复孔。置于细胞培养箱中孵育24h±2h用于试验。5.1.3细胞接种前，应在细胞培养板背面用记号笔和直尺横向划直线进行标记，每孔标记2条线，两条线间间隔距离宜为2.0cm。5.2样品制备5.2.1受试物的配制应根据受试物理化特性选择合适的溶剂配置成受试物工作液，配制要求如下：a)水溶性物质：宜选细胞培养液作为溶剂，配置成高浓度母液（母液中受试物的浓度应为试验浓度的10倍～1000倍），过滤除菌，然后使用细胞培养液稀释到试验浓度；b)非水溶性物质：非水溶性物质：宜选二甲基亚砜或无水乙醇作为溶剂，配置成高浓度母液（母液中受试物的浓度应为试验浓度的100倍～1000倍），过滤除菌，其中二甲基亚砜或无水乙醇的体积在溶液中应低于1%。5.2.2受试物浓度的选择应通过细胞毒性试验确定受试物安全浓度范围，以受试物处理细胞后细胞活力≥90%时的浓度为安全浓度的最高浓度，在安全浓度范围内，选择1个～3个浓度作为受试物试验浓度。5.3实验分组试验过程中应按以下要求分组：a)空白对照组：使用角质形成细胞培养基培养细胞；b)阳性对照组：使用含有阳性物的角质形成细胞培养基培养细胞，阳性物宜选择具有显著促进人源角质形成细胞迁移的活性物，如1ng/mLEGF；c)受试物组：使用含有一定浓度的受试物的角质形成细胞培养基培养细胞。6测试6.1受试物孵育DB61/T1815—20244应弃掉培养孔中的细胞培养液，更换新的培养液，操作过程按照5.3要求进行，各组细胞孵育时间宜为24h±2h。6.2划痕每孔细胞铺板率应达到90%～100%，划痕过程中保持均匀力度，每孔应有2个以上的观察点（如图1所示）。划痕结束后，弃掉培养液，应使用磷酸盐缓冲溶液洗去脱落细胞，并于1mL磷酸盐缓冲溶液进行拍照观察。图16孔板划痕示意图6.3一次拍照划痕结束后利用倒置显微镜进行拍照，宜在放大倍数为4倍的物镜对观察点拍照，每孔拍摄不低于3张照片，记录初始划痕面积。6.4换液拍照结束应弃掉磷酸盐缓冲溶液，每孔更换为角质形成细胞培养液，细胞培养箱中孵育24h±2h。6.5二次拍照孵育结束按照6.3要求记录24h划痕面积。7数据分析7.1图片处理7.1.1计算初始和24h划痕面积，图片处理方法见附录A。7.2数据计算每组应取3个复孔的平均值作为检测结果，结果表示为平均值±标准差（Mean±SD）。计算公式见式（1）：Migrationrate=(S0h-S24h)/S0h×100%…………(1)式中：Migrationrate——迁移率（%）；S0h——0h划痕面积（cm2S24h——24h划痕面积（cm2）。7.3统计分析DB61/T1815—20245数据应使用t检验、双尾检验分析显著性差异。与空白对照组相比，p<0.05则认为其具有统计学差异。7.4精密度试验中每组3个复孔的检测数据的变异系数（CoefficientofVariation，C.V）应≤20%。变异系数计算见式（2C.V=(SD/Mean)×100%…………(2)式中：C.V——变异系数(%)；SD——迁移率的标准差；Mean——迁移率的平均值。8测试报告宜包括但不限于以下几个方面的内容：——目的；——材料；——设备；——受试物信息；——方法；——数据与统计分析；——结果。9质量保证9.1细胞接种24h后，细胞铺板率应达到70%～80%。9.2划痕前每孔细胞铺板率应达到90%～100%。9.3与空白对照组相比，阳性对照组的迁移率提升且具有统计学差异（p<0.05）。DB61/T1815—20246图片处理方法以ImageJ图像分析软件为例，进行图片处理方法的说明。A.1图片统一化处理获得照片后，应进行统一化处理。设置包含所有划痕所在区域画板，导入原始划痕图片，以记号笔标记为基准定位到同一位置，裁切划痕图片。经过以上操作，可以保证两个时间点的图片取样位置相同、图片尺寸相同，具有可比性。A.2划痕面积计算使用ImageJ软件进行划痕面积的计算。导入要计算的图片，执行以下命令：a)Image-Type-8-bit黑白化处理；b)Process-Smooth画面平滑；c)Process-Findedges增强边缘显示；d)Process-Filters-GaussianBlur-（Sigma