DB34∕T 3861-2021 畜禽血清中黄曲霉毒素B1生物标志物的测定 高效液相色谱法

ICS01.120

CCSA00

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安徽省地方标准

DB34/T3861—2021

畜禽血清中黄曲霉毒素B1生物标志物的测

定高效液相色谱法

DeterminationofAFB1biomarkerinserumhighperformanceliquid

chromatographicmethod

2021-01-25发布2021-02-25实施

安徽省市场监督管理局发布

DB34/T3861—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由安徽农业大学提出。

本文件由安徽省农业标准化技术委员会归口。

本文件起草单位：安徽农业大学、安徽浩翔农牧有限公司（农业农村部猪肉质量安全控制重点实验

室）、望江县小月山农业发展有限公司、和县农业农村局、望江县畜牧兽医局、安徽省动物疫病预防与

控制中心、安徽省农业科学院畜牧兽医研究所、宿松县春润食品有限公司。

本文件主要起草人：王希春、杨长根、陈祥国、赵家喜、沈艳、高亚飞、王军、汤继顺、赵杰、吴

金节、李玉、冯士彬、孙裴、涂健、冯江华。

I

DB34/T3861—2021

畜禽血清中黄曲霉毒素B1生物标志物的测定高效液相色谱法

1范围

本文件确立了畜禽血清中黄曲霉毒素B1生物标志物含量的高效液相色谱法测定方法，并规定了测定

原理、试剂和设备、测定步骤、测定结果的表述、重复性、检出限与定量限、回收率。

本文件适用于畜禽血清中AFB1生物标志物的测定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

黄曲霉毒素B1AflatoxinB1，AFB1

主要由黄曲霉与寄生曲霉代谢产生的一种真菌毒素，进入体内以后会与血液白蛋白中的赖氨酸

（Lysine）结合形成稳定的生物标志物AFB1-Lysine。

4原理

通过蛋白酶的消化，从血清白蛋白中释放出AFB1生物标志物，采用固相萃取柱浓缩。浓缩的AFB1

生物标志物经高效液相色谱仪分离，用荧光检测器检测。

5试剂和设备

5.1试剂与材料

5.1.1甲醇（CH3OH）：色谱纯。

5.1.2蛋白酶。

5.1.3磷酸二氢铵（NH4H2PO4），分析纯。

5.1.4叠氮化钠（NaN3），分析纯。

5.1.5白蛋白试剂（DMA）：生物试剂。

5.1.6蛋白检测染料试剂浓缩液（考马斯亮蓝G-250）

5.1.7氯化钠（NaCl），分析纯。

5.1.8磷酸氢二钠（Na2HPO4），分析纯。

5.1.9磷酸二氢钾（KH2PO4），分析纯。

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5.1.10氢氧化铵（NH4OH），分析纯。

5.1.11甲酸（HCOOH），分析纯。

5.1.12AFB1生物标志物标准品AFB1-Lysine（纯度≥99％）。

5.1.13除另外说明外，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682的一级水。

5.2仪器与设备

5.2.1高效液相色谱仪（含荧光检测器、柱温箱）。

5.2.2水浴恒温摇床。

5.2.3固相萃取柱（1cc/30mg）。

5.2.4粒径5µmC18高效液相色谱柱（Ø250×4.6mm）。

5.2.5涡旋振荡器。

5.2.6微量进样器。

5.2.7天平（感量0.0001g）。

5.2.8pH计。

5.2.9-80℃超低温冰箱。

5.2.10冷冻离心机：转速≥3500g。

5.2.11紫外分光光度计。

6测定步骤

6.1样品制备

无菌采集新鲜血液5mL，室温静置2h，2000g离心15min，取上清液转移至另一离心管中。

6.2总蛋白及白蛋白含量测定

6.2.1血清总蛋白浓度测定

6.2.1.14℃下精密称取1mg/mL蛋白标准品置于玻璃管中用于制备标准曲线，各管添加量见表1。

表1血清总蛋白标准曲线绘制

标准溶液水标准

序号

(μL)(μL)(μg)

108000

227982

347964

467946

587928

61079010

71578515

6.2.1.2取待测血清5μL至离心管中，加入95μL水稀释样品，涡旋混合均匀，然后将4μL稀

释样品转移到预先添加796μL水的玻璃试管中；向所有管中加入200μL考马斯亮蓝G-250，室温

下涡旋，混合均匀转移至待测试管中；以试管1作为空白，在595nm的波长下，使用紫外分光光度

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计进行测量；记录标准品和样品的吸光度读数，根据标准吸光度制作标准曲线，由公式计算可得总蛋白

浓度。

6.2.1.3血清总蛋白含量计算公式见公式（1）、公式（2）、公式（3）：

标准曲线：

yaxb··········································································(1)

(A-b)

X······································································(2)

a

X×20×250×150

150μL血清总蛋白浓度C····································(3)

1000

式中：

X——待测血清中总蛋白含量（μg）；

A——待测血清吸光度读数；

a——标准曲线斜率；

b——标准曲线截距。

6.2.2血清白蛋白含量测定

6.2.2.14℃下取4g/dL蛋白标准品溶液置于玻璃管中用于制备标准曲线，各管添加量见表2。

表2血清白蛋白标准曲线制备

标准品溶液水标准品

序号

(μL)(μL)(μg)

10200

22.517.5100

3515200

47.512.5300

51010400

6155600

7200800

6.2.2.2取待测血清10μL置于一个单独的玻璃试管，并在管内加10μL水；向所有管中加入1mLDMA，

室温下涡旋；混合均匀转移至待测试管中，以试管1作为空白，在630nm的波长下，使用紫外分光光

度计进行测量；记录标准品和待测血清的吸光度读数，根据标准吸光度制作标准曲线，由公式计算可得

血清白蛋白含量。

6.2.2.3150μL血清白蛋白计算公式见公式（4）、公式（5）、公式（6）：

标准曲线：

yaxb··········································································(4)

(A-b)

X······································································(5)

a

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X

150μL血清白蛋白浓度150μL·················································(6)

10

式中：

X——10μL待测血清中白蛋白含量（μg）；

A——待测血清吸光度读数；

a——标准曲线斜率；

b——标准曲线截距。

6.3蛋白质消化

在离心管中添加150μL血清和10mg/mL蛋白酶（附录A.1.7），血清与蛋白酶比例为1:4，酶

C

需要量为血清总蛋白含量（mL），37℃水浴摇床中孵育3h，确保水位达到标准线，样品在

1000×4×10

摇床上消化3h。

6.4待测样本纯化

加入1mL水、1mL甲醇激活平衡固相萃取柱，自然流出，依次加入待测血清，1.0mL/min的流

速顺序分两次各加入1mL水洗涤、1mL甲醇-水溶液（附录A.1.4）和氢氧化铵（附录A.1.8）洗涤，

在0.5mL甲醇中洗脱后干燥，用1mL甲酸-水溶液（附录A.1.5）洗脱纯化两次，收集洗脱液，干

燥55min。向所得干燥物中加入150μL甲醇-水溶液（附录A.1.3），涡旋5min，3500g离心5min，

在2min内进样分析。

6.5仪器设定条件

6.5.1色谱柱：C18柱，Ø250mm×4.6mm，5μm或相当者。

6.5.2检测波长：激发波长405nm，发射波长470nm。

6.5.3流动相：A相:磷酸二氢铵（附录A.1.1）（含叠氮化钠）；B相:甲醇。梯度洗脱，洗脱程序见

表3。

6.5.4流速：1.0mL/min。

6.5.5柱温：25℃。

6.5.6进样量：150μL。

表3流动相洗脱程序

时间流动相A流动相B

min％％

03070

53070

156535

186535

203070

6.6试样溶液的测定

6.6.1在6.5色谱条件下，将150.0μLAFB1生物标志物标准工作溶液（附录A.2.2）按浓度从低到

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高依次注入高效液相色谱仪，AFB1生物标志物标准品色谱图参考附录B；待仪器条件稳定后，以目标物

质的浓度为横坐标（x轴），目标物质的峰面积为纵坐标（y轴），对各个数据点进行最小二乘线性拟

合，标准曲线见公式（7）：

yaxb··········································································(7)

式中：

y——目标物质的峰面积比；

a——标准曲线的斜率；

x——目标物质的浓度；

b——标准曲线的截距。

6.6.2标准工作溶液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内，如果样本含量超过标准曲

线范围，需稀释后再测定。

6.7空白试验

不加入标准品，按6.3、6.4的步骤做空白实验。确认不含有干扰待测组分的物质。

7测定结果的表述

样品分析见公式（8）：

ci×V×f

X103····································································(8)

m

式中：

X——待测血清白蛋白中AFB1生物标志物的含量，单位为皮克每毫克（pg/mg）；

ci——待测物进样液中AFB1生物标志物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

V——定容体积，单位为毫升（mL）；

f——试液稀释倍数；

m——150.0μL血清中白蛋白含量，单位为毫克（mg）。

注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留两位有效数字。

8重复性

血清样本中AFB1生物标志物含量在重复性条件下获得的绝对差值不得超过算术平均值的15％。

9检出限与定量限

本标准血清AFB1生物标志物的最低检出限为0.02ng/mL，定量限为1.0ng/mL。

10回收率

添加浓度在0.5ng/mL～1.0ng/mL时，回收率在75％～94％之间。

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附录A

（规范性）

试剂与标准品溶液配制

A.1溶液配制

A.1.1磷酸二氢铵（20mmol/L，pH7.2）：称取2.3g无水磷酸二氢铵，溶于1000mL水中，用氨

水调pH至7.2，混合均匀。

A.1.2叠氮化钠（0.001％）：称取叠氮化钠1.0mg，溶于100mL水，混合均匀。

A.1.3甲醇-水溶液（25+75）：分别量取25