【《柠檬皮多酚对酶抑制作用及抗氧化活性实证分析案例》4200字】

柠檬皮多酚对酶抑制作用及抗氧化活性实证分析案例目录TOC\o"1-3"\h\u31484柠檬皮多酚对酶抑制作用及抗氧化活性实证分析案例 1183241.1材料与设备 1239731.1.1仪器与设备 1221041.1.2材料与试剂 2287341.2试验方法 3144601.2.1柠檬皮多酚的制备 3307521.2.2柠檬皮多酚体外对代谢相关酶的抑制作用 385871.2.3柠檬皮多酚体外抗氧化活性作用 461321.3数据处理 565711.4结果与讨论 5283881.4.1α-淀粉酶的抑制活性结果 511641.4.2α-葡萄糖苷酶的抑制活性结果 6220851.4.3柠檬皮多酚与阿卡波糖的IC50值比较 8289191.4.4DPPH自由基清除能力的测定结果 8229091.4.5羟自由基清除能力的测定结果 9321391.4.6总还原力能力测定结果 987571.4.7柠檬皮多酚与Vc的IC50值比较 10与糖代谢相关的酶有α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶，他们可影响碳水化合物的消化和吸收，是人体内关键的糖苷水解酶；机体吸收的葡萄糖、麦芽糖等，都是由人体内摄入的碳水化合物，如淀粉、蔗糖等分解形成的[97]。为了防止餐后血糖迅速升高，可以对两种酶活性进行抑制，从而延缓人体对淀粉等物质的降解和对葡萄糖的吸收，有利于预防和治疗糖尿病和肥胖症等疾病[98]。多酚是一种具有较强抗氧化效果的抗氧化剂，具有很强的自由基清除能力，可以阻止氧化反应的产生[99]，且适量的活性氧和自由基可以维持身体健康和生理平衡。本章在上述柠檬皮多酚的提取、纯化的基础上，通过柠檬皮多酚纯化物对糖代谢相关酶α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用及柠檬皮多酚的DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力和总还原力等抗氧化性质进行深入研究。材料与设备仪器与设备仪器与设备试验中所用仪器设备见表3-1所示：表3-1试验仪器设备Tab.3-1Experimentalapparatus仪器名称型号厂家紫外可见分光光度计UV1800上海棱光技术有限公司超声波清洗器KQ-250DE昆山市超声仪器有限公司真空冷冻干燥机FDU-1100日本东京理化仪器有限公司电子天平JJ200型电子天平美国双杰兄弟有限公司离心机JRA-5000上海市离心机械研究所水浴锅HWS-26上海一恒科学仪器有限公司旋转蒸发仪RE-25AA上海亚荣生化有限公司材料与试剂原材料：柠檬购买于海南，本章所需主要试剂见表3-2。表3-2主要试剂Tab.3-2Mainreagents名称等级生产厂家无水乙醇分析纯天津市光复科技发展有限公司没食子酸分析纯上海源叶生物科技有限公司氢氧化钠分析纯天津市光复科技发展有限公司无水碳酸钠分析纯天津市光复科技发展有限公司α-葡萄糖苷酶分析纯罗恩化学试剂有限公司α-淀粉酶分析纯北京奥博星生物技术有限公司可溶性淀粉分析纯天津市光复科技发展有限公司对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷分析纯上海源叶生物科技有限公司磷酸氢二钠分析纯天津市光复科技发展有限公司磷酸二氢钠分析纯天津市光复科技发展有限公司DPPH分析纯上海源叶生物科技有限公司30%双氧水分析纯天津市光复科技发展有限公司硫酸亚铁分析纯天津市光复科技发展有限公司水杨酸分析纯天津市光复科技发展有限公司铁氰化钾分析纯天津市光复科技发展有限公司抗坏血酸分析纯天津市光复科技发展有限公司阿卡波糖分析纯美国Sigma公司3,5-二硝基水杨酸分析纯天津市光复科技发展有限公司三氯乙酸分析纯天津市光复科技发展有限公司试验方法柠檬皮多酚的制备柠檬皮多酚制备方法见2.2.1。柠檬皮多酚体外对代谢相关酶的抑制作用柠檬皮多酚对α-淀粉酶的抑制作用根据贺银菊等[100]方法，用磷酸盐缓冲溶液（200mM，pH6.9）将柠檬皮多酚、阿卡波糖、α-淀粉酶溶液(1U/mL)及可溶性淀粉溶液（1%，m/V）配制成所需要的浓度。采用2mL反应体系，每个样品设置7个不同的浓度梯度，在540nm处测定吸光值。酶抑制试验重复3次，取平均值。表3-3α-淀粉酶活性抑制体系表/mLTab.3-3Tableofα-amylaseactivityinhibitionsystem/mL样品酶液抑制剂淀粉溶液PBSDNSA10.50.50.50.51A2-0.50.511A30.5-0.511A4--0.51.51α-淀粉酶抑制率/%=（3.1）式中：A1为样品管的吸光度值，A2为磷酸缓冲液替代样品后的吸光度值，A3表示为磷酸缓冲液替代α-淀粉酶溶液后的吸光度值，A4表示磷酸缓冲液替代样品和α-淀粉酶溶液后的吸光度值。柠檬皮多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制作用参照吴少锦[101]的方法进行试验，采用1mL反应体系，每个样品设置8个不同的浓度梯度，以及背景对照管、空白对照管，以阿卡波糖为阳性对照，反应体系见表3-4，在405nm处测定吸光值。酶抑制试验重复3次，取平均值。表3-4α-葡萄糖苷酶活性抑制体系表/mLTab.3-4Tableofα-glucosidaseactivityinhibitionsystem/mL样品酶液抑制剂PNPGPBSDNSA10.60.10.10.25A2-0.10.10.85A30.6-0.10.35A4--0.10.95α-葡萄糖苷酶抑制率/%=（3.2）式中：A1为样品的吸光度值，A2为磷酸缓冲液替代样品后的吸光度值，A0为磷酸缓冲液替代α-葡萄糖苷酶溶液后的吸光度值，A4表示磷酸缓冲液替代样品和α-葡萄糖苷酶溶液后的吸光度值。柠檬皮多酚体外抗氧化活性作用DPPH自由基清除能力的测定参照尤昕等[102]的方法进行试验，采用4mL体系，Vc为阳性对照，每个样品设置5个不同的浓度梯度，。反应体系见表3-5，室温避光静置45min，于517nm处测吸光度值，计算清除率：表3-5DPPH自由基清除体系表/mLTab.3-5TableofDPPHfreeradicalscavengingsystem/mL样品DPPH乙醇蒸馏水空白管-3-1样品管13--对照管1-3-清除率/%=（3.3）式中：A0（517nm）——空白的吸光度；A1（517nm）——样品的吸光度；A2（517nm）——对照管吸光度羟自由基清除能力的测定参照曹艳华[103]的方法进行试验，采用5mL体系，Vc为阳性对照，每个样品设置5个不同的浓度梯度，。反应体系见表3-6，在510nm处测吸光度，计算清除率：表3-6羟自由基清除体系表/mLTab.3-6TableofHydroxylfreeradicalscavengingsystem/mL样品H2O2水杨酸-乙醇溶液FeSO4蒸馏水空白管-1112样品管11111对照管11--3清除率/%=（3.4）式中：A0（510nm）——空白的吸光度；A1（510nm）——样品的吸光度；A2（510nm）——为对照管的吸光度总还原力能力测定参照PanYingming[104]的方法进行试验，Vc为阳性对照，每个样品设置5个不同的浓度梯度，于700nm处测定其吸光值。根据吸光值对总还原力进行判断，吸光值越强，还原力能力越大。表3-7总还原力反应体系表/mLTab.3-7Tableoftotalreducingpowerreactionsystem/mL样品铁氰化钾三氯化铁三氯乙酸蒸馏水PBS空白管-2.50.52.52.53.5样品管12.50.52.52.52.5数据处理SPSS19.0软件对数据进行方差分析（图中用不同字母标注差异显著性），用OriginPro8.5作图。结果与讨论α-淀粉酶的抑制活性结果当柠檬皮多酚与阳性对照阿卡波糖浓度均在0-1.5mg/mL时，其对α-淀粉酶的作用如图3-1所示。图3-1柠檬皮多酚对α-淀粉酶的抑制效果Fig.3-1Inhibitoryeffectoflemonpeelpolyphenolsonα-amylase注:不同字母表示差异显著性由图3-1可知，柠檬皮多酚提取液与阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制率与相对浓度呈正比，抑制曲线有相似的变化趋势，在0-1mg/mL浓度范围内，对α-淀粉酶的抑制率随着浓度不断增加，当浓度为1mg/mL时阿卡波糖与柠檬皮多酚提取液同时出现拐点，继续增大浓度，抑制作用无明显变化（P＞0.05），达到平台期，当柠檬皮多酚提取液溶度为1.5mg/mL时，α-淀粉酶抑制率最高，可达到50.39%。由此，可以推论柠檬皮多酚降糖原理与阿卡波糖相似，柠檬皮多酚通过与α-淀粉酶相结合，抑制了α-淀粉酶活力，从而控制餐后血糖的升高。α-葡萄糖苷酶的抑制活性结果当柠檬皮多酚浓度在0-5mg/mL时，其对α-葡萄糖苷酶的作用如图3-2所示；当阳性对照阿卡波糖浓度在0-1.5mg/mL时，其对α-葡萄糖苷酶的作用如图3-3所示。图3-2柠檬皮多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制效果Fig.3-1Inhibitoryeffectoflemonpeelpolyphenolsonα-glucosidase注:不同字母表示差异显著性图3-3阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制效果Fig.3-3Inhibitoryeffectofacarboseonα-glucosidase注:不同字母表示差异显著性从图3-2和图3-3可以看出，阿卡波糖和多酚提取物柠檬皮中的对α-葡萄糖苷酶的起作用的浓度范围的不同，但作用类型相似，均有一定的线性关系，是呈增加关系的。当浓度为1.5mg/mL时（P＞0.05）柠檬皮多酚的抑制作用与阳性对照阿卡波糖的抑制作用无显著性差异，说明在此浓度下柠檬皮多酚与阿卡波糖在抑制作用一样，柠檬皮多酚浓度为0.6mg/mL时（P＜0.05），对α-葡萄糖苷酶的抑制作用大于阿卡波糖；柠檬皮多酚的抑制作用小于阿卡波糖，在浓度达到1.5mg/mL下，α-葡萄糖苷酶的抑制作用与阿卡波糖相似。柠檬皮多酚与阿卡波糖的IC50值比较表3-8柠檬皮多酚与阿卡波糖酶抑制能力的IC50值Tab.3-8IC50valueoflemonpeelpolyphenolsandacarboseinhibitionability名称α-淀粉酶抑制能力/(mg/mL)α-葡萄糖苷酶抑制能力/(mg/mL)柠檬皮多酚1.524±0.1620.451±0.050阿卡波糖0.318±0.0250.542±0.046柠檬皮多酚与阳性对照阿卡波糖对α-淀粉酶的半抑制率分别为1.524mg/mL和0.318mg/mL，虽相差较大，但作用趋势一致，说明柠檬皮多酚对α-淀粉酶具有一定的抑制作用；且其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用在作用范围内半抑制率分别为0.451mg/mL和0.542mg/mL，半抑制率结果相似，说明柠檬皮多酚在体外对α-葡萄糖苷酶有抑制作用大，具有很强的降血糖活性。同时说明柠檬皮多酚可以用来对糖尿病进行防御，并可进一步开发利用。DPPH自由基清除能力的测定结果当柠檬皮多酚与阳性对照Vc浓度均在0-1mg/mL时，其对DPPH自由基清除能力如图3-4所示。图3-4DPPH自由基清除率的测定Fig.3-4DeterminationofDPPHradicalscavengingrateDPPH是一种稳定性较强的自由基，作为DPPH自由基清除剂需要具备提供氢并使DPPH形成稳定的非自由基DPPH-H分子的能力[105]。从图3-4可以看出，柠檬皮多酚提取液对DPPH自由基的清除能力与Vc清除自由基能力的线性关系相似，当柠檬皮多酚提取液的浓度为0.4mg/mL时（P＞0.05），自由基清除率与Vc基本一致，无显著性差异，但是在浓度大于0.4mg/mL时，自由基的清除力作用效果与Vc相比较低。羟自由基清除能力的测定结果当柠檬皮多酚与阳性对照Vc浓度均在0-1mg/mL时，其对羟自由基清除能力如图3-5所示。图3-5羟自由基清除率的测定Fig.3-5Determinationofhydroxylradicalscavengingrate·OH是一种很重要的活性氧簇[106]，其清除机制分3为两种：一种是通过抑制·OH的产生，另一种是清除产生的·OH，从而达到抗氧化作用。由图3-5可知，柠檬皮多酚和Vc对羟自由基均具有一定的清除能力，在浓度为0.6mg/mL时（P＞0.05），柠檬皮多酚的作用效果与阳性对照Vc无显著性差异，作用效果一样；当柠檬皮多酚浓度小于0.6mg/mL时，其对羟自由基的清除率低于Vc，但是当其浓度大于0.6mg/mL时，柠檬皮多酚对羟自由基清除能力高于Vc。由此图也可以看出，柠檬皮多酚对羟自由基的清除率随浓度的增大而增大。总还原力能力测定结果当柠檬皮多酚与阳性对照Vc浓度