DB35∕T 1943-2020 百香果（西番莲）病毒检测技术规程

ICS65.020.01

CCSB16

35

福建省地方标准

DB35/T1943—2020

百香果（西番莲）病毒检测技术规程

Technicalrulesforvirusdetectionofpassifloraedulia

2020-12-30发布2021-03-30实施

福建省市场监督管理局发布

DB35/T1943—2020

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由福建省农业农村厅提出并归口。

本文件起草单位：福建省种植业技术推广总站、福建省农业科学院果树研究所。

本文件主要起草人：李韬、谢丽雪、施清、杨建榕、张立杰、张小艳、郑姗、谢钟琛、林诚智。

I

DB35/T1943—2020

百香果（西番莲）病毒检测技术规程

1范围

本文件规定了百香果主要病毒的检测对象、仪器设备、用具及试剂、抽样、检测、结果判定、结果

记录、样品保存和归档。

本文件适用于百香果上主要病毒（东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒、黄瓜花叶病毒）的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法

SN/T2964植物病毒检测规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4检测对象

选择西番莲生产上分布范围广、危害严重的东亚西番莲病毒（EastAsianpassifloravirus，EAPV）、

夜来香花叶病毒（Telosmamosaicvirus，TeMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）为

检测对象，各病毒的信息参见附录A。

5仪器设备、用具及试剂

5.1仪器设备

高速冷冻离心机、电子天平（1/1000g）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、-20℃低温冰箱和-80℃

超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、酶标仪等。

5.2用具

各种量程的可调移液器（1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2μL）、PCR反应管、

无RNase的PCR离心管（1.5mL）、研钵、酶联板等。

5.3试剂

1

DB35/T1943—2020

除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。DAS-ELISA试剂按照

附录B要求，RT-PCR试剂按照附录C要求。

6抽样

有病毒危害症状的植物材料（叶、果实）单独抽样；无危害症状的植物材料（叶、果实）抽样方法

按照SN/T2122和SN/T2964中规定执行。

7检测

7.1DAS-ELISA

DAS-ELISA具体方法按照附录B检测。

7.2RT-PCR

RT-PCR具体方法按照附录C检测。

8结果判定

8.1东亚西番莲病毒

若样品经DAS-ELISA、RT-PCR检测结果均为阳性，则判定为检出EAPV；若样品经RT-PCR检测为阳性，

且序列测定结果为该病毒核苷酸序列，则判定为检出EAPV；反之，则判定为未检出EAPV。

8.2夜来香花叶病毒

若样品经DAS-ELISA、RT-PCR检测结果均为阳性，则判定为检出TeMV；若样品经RT-PCR检测为阳性，

且序列测定结果为该病毒核苷酸序列，则判定为检出TeMV；反之，则判定为未检出TeMV。

8.3黄瓜花叶病毒

若样品经DAS-ELISA、RT-PCR检测结果均为阳性，则判定为检出CMV；若样品经RT-PCR检测为阳性，

且序列测定结果为该病毒核苷酸序列，则判定为检出CMV；反之，则判定为未检出CMV。

9结果记录

记录包括样品来源、样品种类、检测时间、检测地点、检测方法和结果、检测人员签字。DAS-ELISA

检测应有酶联反应数值；RT-PCR检测应有电泳图片。

10样品保存和归档

经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在-20℃～-80℃冰箱中，并作好登记和标记工作，以备

复核用。

2

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A

A

附录A

（资料性）

东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒、黄瓜花叶病毒的背景资料

A.1分类地位

A.1.1东亚西番莲病毒

学名：EastAsianpassifloravirus，缩写：EAPV。

分类地位：马铃薯Y病毒科（Potyviridae）、马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员。

A.1.2夜来香花叶病毒

学名：Telosmamosaicvirus，缩写：TeMV。

分类地位：马铃薯Y病毒科（Potyviridae）、马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员。

A.1.3黄瓜花叶病毒

学名：Cucumbermosaicvirus，缩写：CMV。

分类地位：雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）、黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）成员。

A.2分布地区

EAPV：主要分布于日本、韩国以及我国台湾地区；TeMV：主要分布于越南、泰国、印度尼西亚、中

国；CMV：国内外西番莲种植地区均有分布。

A.3危害症状

EAPV：主要引起西番莲叶片花叶、果实畸形和木质化，见图A.1；TeMV：主要引起叶片花叶，见图

A.2；CMV：叶片出现亮黄色的斑点，见图A.3。

图A.1EAPV侵染引起的症状

3

DB35/T1943—2020

图A.2TeMV侵染引起的症状

图A.3CMV侵染引起的症状

A.4传播途径

EAPV:蚜虫、机械摩擦传播；TeMV：机械摩擦传播；CMV：蚜虫、机械摩擦传播。

A.5粒体形态

EAPV：线状粒体，长约800nm；TeMV：线状粒体，长约750nm；CMV：球状粒体，直径28nm～30nm。

4

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B

B

附录B

（规范性）

双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）

B.1试剂

B.1.1包被抗体

特异性的病毒（EAPV、TeMV、CMV）抗体。

B.1.2酶标抗体

碱性磷酸酯酶标记的病毒抗体。

B.1.3底物

对硝基苯磷酸二钠（ρNPP）。

B.1.41×PBST缓冲液（pH7.4）

氯化钠（NaCl）8.0g

磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g

磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.15g

氯化钾（KCl）0.2g

吐温-20（Tween-20）0.5mL

溶于900mL灭菌ddH2O中，并定容至1000mL，4℃储存。

B.1.5样品抽提缓冲液（pH7.4）

亚硫酸钠（Na2SO3）1.3g

聚乙烯基吡咯烷酮（PVP,MW24000-40000）20.0g

溶于900mL的1×PBST中，并用1×PBST定容至1000mL，4℃储存。

B.1.6包被缓冲液（pH9.6）

碳酸钠（Na2CO3）1.59g

碳酸氢钠（NaHCO3）2.93g

溶于900mL灭菌ddH2O中，并定容至1000mL，4℃储存。

B.1.7酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4）

牛血清白蛋白（BSA）2.0g

聚乙烯基吡咯烷酮（PVP,MW24000-40000）20.0g

溶于900mL1×PBST中，并用1×PBST定容至1000mL，4℃储存。

B.1.8底物缓冲液(pH9.8)

二乙醇胺97mL

氯化镁（MgCl2）0.1g

溶于800mL灭菌ddH2O中，用浓盐酸（HCl）调pH至9.8，定容至1000mL，4℃储存。

B.2程序

5

DB35/T1943—2020

B.2.1样品制备

B.2.1.1待测样品

称取0.5g～1.0g样品组织，待测样品按1:10（重量:体积，W/V）加入抽提缓冲液，用研钵研磨成

浆，8000g离心10min，上清即为制备好的检测样品。

B.2.1.2阳性对照样品

携带相关病毒的样品组织抽提液。

B.2.1.3阴性对照样品

健康的西番莲叶片组织抽提液。

B.2.1.4空白对照

用抽提缓冲液作空白对照。

B.2.2包被抗体

用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，100μL/孔，加盖，37℃孵育2h或4℃冰

箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，按每孔200μL的量用PBST洗涤4～6次，每次1min。

B.2.3加样

加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照、空白对照，2个重复，100μL/孔，加盖，37℃孵

育2h或4℃冰箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，按每孔200μL的量用PBST洗涤4～6次，每次1min。

B.2.4加酶标抗体

用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入到酶联板中，100μL/孔，加盖，

37℃孵育2h，倒去酶联板孔中溶液，PBST洗涤4～6次，每次1min。

B.2.5加底物

将底物ρNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL（现配现用），按100μL/孔，加入到酶联板

中，室温避光孵育30min。

B.2.6读数

酶标仪在405nm处读OD值。

B.3结果判断

在满足阴性对照的OD405nm值<0.15、阳性对照的OD405nm值/阴性对照孔的OD405nm值>5～10、重

复性基本一致的质量要求下：

a)样品OD405nm值/阴性对照OD405nm值>2，判为阳性；

b)样品OD405nm值/阴性对照OD405nm值<2，判为阴性；

c)样品OD405nm值/阴性对照OD405nm值在阈值2附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用

其他方法加以验证。

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C

C

附录C

（规范性）

普通RT-PCR检测方法

C.1试剂

C.1.1TrizoL裂解液

C.1.25×TBE缓冲液

Tris碱54.0g

硼酸（H3BO3）27.5g

0.5mol/LEDTA（pH8.0）20mL

补充蒸馏水至1L。用时加蒸馏水稀释至0.5×TBE。

C.1.36×加样缓冲液

0.25%溴酚蓝

40%（W/V）蔗糖水溶液。

C.1.4氯仿、异丙醇、75%乙醇、无水乙醇。

C.1.5RT缓冲液。

C.1.6dNTPs：10mmol/L。

C.1.7M-MLVRT：200U/μL。

C.1.8RNasin：40U/μL。

C.1.9TaqPCRmix。

C.1.10引物序列

根据已报道的东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒、黄瓜花叶病毒基因组序列设计用于特异性扩增的

引物（表C.1）。

表C.1PCR扩增引物

病毒名称引物名称引物序列（5´-3´）目的片段（bp）

正向引物

CTTGCATGTCCTAGACCTCG

EAPV-F

东亚西番莲病毒955

反向引物

AACTGTGGTCGGTTTACCCAA

EAPV-R

正向引物

TCAAGTAAGGTGGATGATGTT

TeMV-F

夜来香花叶病毒816

反向引物

CTGCACAGAGCCAACCCCAA

TeMV-R

正向引物

ATGGACAAATCTGAATCAACC

CMV-F

黄瓜花叶病毒657

反向引物

TCAGACTGGGAGCACTCCA

CMV-R

C.2RT-PCR检测

7

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C.2.1总RNA提取

样品提取液的制备同B.2.1。取样品提取液200μL放入1.5mL离心管中，再加入1mLTrizoL试剂，

剧烈震荡摇匀3min；4℃，12000g离心10min，取上清；加入氯仿300μL，剧烈震荡15s，室温静

置5min，4℃，12000g离心15min，取上层水相；加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温下静置15min，

4℃，12000g离心10min，弃上清；加入1mL75%的乙醇洗涤沉淀2次，7500g离心3min，弃上清；

RNA沉淀干燥后，用20μL～40μL经DEPC（焦碳酸二乙酯）处理过的ddH2O溶解，-80℃保存备用。

C.2.2cDNA合成

在PCR管中加入3μL总RNA，1μL反向引物（10μmol/L），DEPC处理过的ddH2O7μL，70℃水

浴10min，迅速冰浴5min，再加入下列试剂：5×RT缓冲液5μL、dNTPs（10mmol/L）2μL、M-MLVRT

（200U/μL）1μL、RNasin（40U/μL）1μL。42℃水浴60min，70℃水浴10min，自然冷却至

室温，-20℃保存备用。

C.2.3PCR扩增

PCR反应体系见表C.2，每个反应设置2个重复。检测时以含有病毒目标片段的质粒或含病毒材料作

为阳性对照，以不含病毒的健康植物组织作阴性对照，同时以水代替模板作为空白对照。

EAPV的PCR反应条件：94℃预变性5min,然后94℃变性30s、48℃退火45s、72℃延伸1min，

35个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min。

TeMV的PCR反应条件：94℃预变性5min,然后94℃变性30s、55℃退火1min、72℃延伸1min，

35个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min。

CMV的PCR反应条件：94℃预变性5min,然后94℃变性30s、55℃退火45s、72℃延伸1min，

35个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min。

表C.2PCR扩增反应体系

名称