免疫学疫苗研制操作规程

免疫学疫苗研制操作规程一、概述

免疫学疫苗研制操作规程是确保疫苗安全、有效生产的关键流程。本规程旨在规范疫苗研制的各个阶段，包括原材料准备、细胞培养、抗原纯化、佐剂添加、疫苗制剂配制、质量控制和放行等环节。遵循本规程有助于降低生产风险，提高疫苗质量，保障公众健康。

二、原材料准备

（一）原材料选择

1.细胞培养基：选择符合GMP标准的细胞培养基，如DMEM或F12培养基，确保pH值在7.2-7.4之间。

2.胰蛋白酶：使用高纯度胰蛋白酶进行细胞消化，浓度控制在0.25%±0.02%。

3.血清：采用胎牛血清（FBS），纯度≥95%，需经过无菌过滤和热灭活处理。

（二）原材料检验

1.每批原材料需进行无菌、内毒素、纯度及效价检测。

2.细胞培养基需检测pH值、电导率、渗透压等指标。

3.血清需进行支原体检测，确保无污染。

三、细胞培养

（一）细胞复苏

1.将冻存细胞置于37℃水浴中解冻，迅速加入预温培养基。

2.解冻后立即接种于T75培养瓶，初始密度控制在1×10^5-2×10^5cells/mL。

（二）细胞传代

1.当细胞融合率达80%-90%时，用胰蛋白酶消化。

2.用PBS缓冲液洗涤2次，弃去旧培养基，加入新鲜培养基。

（三）细胞培养过程监控

1.每日观察细胞生长状态，记录形态变化。

2.每周检测细胞活力，确保≥95%。

3.定期进行支原体检测，防止污染。

四、抗原纯化

（一）抗原表达

1.将编码抗原的重组质粒转染细胞，培养48小时后诱导表达。

2.诱导条件：异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）浓度0.2-0.5mM，温度37℃。

（二）抗原纯化步骤

1.初步纯化：采用镍柱亲和层析，洗脱液为咪唑梯度（0-0.5M）。

2.高度纯化：使用反相高效液相色谱（RP-HPLC），检测峰纯度≥95%。

（三）抗原质量检测

1.SDS检测纯度，计算回收率。

2.西门子乳胶凝集试验检测抗原效价，效价≥1:128为合格。

五、疫苗制剂配制

（一）佐剂选择与配制

1.使用氢氧化铝佐剂，浓度0.25-0.5mg/mL。

2.将佐剂用注射用水配制成等渗溶液，渗透压±5mOsm/kg。

（二）抗原与佐剂混合

1.按比例（抗原:佐剂=1:1）混合，使用涡旋振荡器充分乳化。

2.混合后静置30分钟，观察无沉淀或分层。

（三）最终制剂配制

1.加入防腐剂苯酚，终浓度0.001%-0.002%。

2.灭菌处理：采用巴氏消毒法（62℃，30分钟）。

六、质量控制

（一）无菌检测

1.制剂需进行薄膜过滤法检测，菌落计数≤10CFU/mL。

2.使用黑曲霉和枯草芽孢杆菌进行孢子污染检测。

（二）内毒素检测

1.采用鲎试验法检测，内毒素含量≤0.25EU/mL。

2.每批制剂需重复检测3次，确保结果一致。

（三）效力检验

1.体外细胞培养法检测抗原活性，半数效价（ED50）≥1×10^7IU/mL。

2.小鼠免疫原性试验，免疫后14天血清抗体滴度≥1:2560。

七、放行标准

（一）符合所有预定的生产工艺参数。

（二）所有检验项目结果均符合规定标准。

（三）批生产记录完整，无重大偏差。

（四）包装与标签符合GMP要求。

八、文件记录

（一）生产记录

1.每批生产需记录细胞培养日志、纯化数据、配制过程参数。

2.记录设备校准信息，包括灭菌锅、离心机等。

（二）检验记录

1.保存所有检验报告，包括无菌、内毒素、效力检测数据。

2.建立批放行审核表，由QA部门签字确认。

（三）变更控制

1.任何原材料或工艺变更需填写变更通知单，经批准后方可执行。

2.变更后需重新进行稳定性考察，确保不影响疫苗质量。

**一、概述**

免疫学疫苗研制操作规程是确保疫苗安全、有效生产的关键流程。本规程旨在规范疫苗研制的各个阶段，包括原材料准备、细胞培养、抗原纯化、佐剂添加、疫苗制剂配制、质量控制和放行等环节。遵循本规程有助于降低生产风险，提高疫苗质量，保障公众健康。本规程适用于所有涉及疫苗生产的核心操作活动，是人员培训、过程监控和合规性审查的基础文件。

二、原材料准备

（一）原材料选择

1.细胞培养基：选择符合GMP标准的细胞培养基，如DMEM或F12培养基，确保pH值在7.2-7.4之间。培养基需经过质量评估，包括无菌、无支原体、无致热原（内毒素）和无明显细胞毒性。储存条件为2-8℃，避光保存，有效期根据供应商建议确定，通常为1-2年。使用前需进行复溶、过滤除菌（通常使用0.22μm滤膜）和温度平衡至37℃。

2.胰蛋白酶：使用高纯度胰蛋白酶进行细胞消化，浓度控制在0.25%±0.02%（w/v）。胰蛋白酶需经过无菌检验、内毒素检验和活性测定。储存于-20℃或更低温度，避免反复冻融。使用时需用无Ca²⁺、Mg²⁺的缓冲液（如D-Hanks或PBS）进行适当稀释，并严格控制作用时间（通常为1-5分钟，需通过实验确定最佳时间），以防止细胞过度消化。

3.血清：采用胎牛血清（FBS），纯度≥95%，需经过无菌过滤（0.1μm或0.22μm）和热灭活处理（56℃，30分钟）。血清需进行支原体检测、内毒素检测、蛋白含量测定和效价评估（如对特定病毒的抗体会影响疫苗效力）。储存于-20℃或更低温度，分装使用。建议优先使用低IgG含量的FBS，以减少对后续纯化的影响。

（二）原材料检验

1.每批原材料需进行严格的检验，包括：

(1)无菌检验：采用培养法（如薄膜过滤法接种至合适的液体培养基和固体培养基）检测是否存在微生物污染。

(2)内毒素检验：采用鲎试验法（LAL法）检测样品中的内毒素水平，确保符合预定标准（通常≤0.25EU/mL）。

(3)纯度分析：如适用，通过SDS、HPLC等方法评估原料的纯度。

(4)效价/活性测定：如适用，例如对于酶或生长因子，需测定其活性单位。

2.细胞培养基需检测关键理化指标：

(1)pH值：使用精密pH计检测。

(2)电导率：反映培养基中的离子强度，使用电导率仪检测。

(3)渗透压：使用渗透压计检测，确保与体液接近。

(4)无菌过滤后需再次检测内毒素和微生物。

3.血清需进行特殊检测：

(1)支原体检测：采用特异性支原体检测方法（如PCR或培养法）。

(2)细胞毒性测试：使用正常细胞进行测试，确保血清对目标细胞无毒性。

(3)免疫原性评估：如有可能，评估其对后续免疫应答的影响。

三、细胞培养

（一）细胞复苏

1.将冻存细胞（如冻存管）置于37℃水浴中解冻，迅速加入预温（37℃）的适量培养基（通常为5-10mL），轻轻吹打混匀，避免剧烈摇晃。

2.解冻后立即接种于T75培养瓶中，初始接种密度根据细胞类型和生长特性优化确定，通常为1×10^5-2×10^5cells/mL。加入培养基至总容量约80-90%。

（二）细胞传代

1.观察细胞生长状态，当细胞融合率达80%-90%时，准备进行传代。

2.用预温的PBS缓冲液（37℃）洗涤细胞2次，每次5-10分钟，弃去旧培养基。

3.加入适量预温的胰蛋白酶（按所需消化面积和细胞密度计算用量），置于37℃、5%CO₂培养箱中消化。通过观察显微镜下细胞收缩、变圆来判断消化程度，通常为1-5分钟，具体时间需根据细胞类型和状态优化。

4.当细胞大部分变圆时，加入含血清的培养基终止消化（通常加入培养基体积为胰蛋白酶体积的3-5倍）。

5.用PBS缓冲液洗涤2次，弃去旧培养基，加入新鲜培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。

（三）细胞培养过程监控

1.每日观察细胞生长状态，包括：

(1)形态学：细胞是否贴壁、生长是否均匀、有无异常形态（如多核细胞、空泡、出血等）。

(2)融合度：记录细胞融合百分比。

(3)污染监控：注意有无微生物污染迹象（如培养基浑浊、有漂浮物、颜色改变等）。

2.每周检测细胞活力，采用台盼蓝染色法或MTT法，确保细胞活力≥95%。

3.定期（如每月或每季度）进行支原体检测，对检测到的阳性样品需进行溯源、处理和验证，防止交叉污染。

4.记录所有观察数据和检测结果，存档备查。

四、抗原纯化

（一）抗原表达

1.将编码抗原的重组质粒通过合适的转染方法（如脂质体法、电穿孔法）转染到宿主细胞中。转染效率需通过预实验进行优化。

2.转染后，根据细胞类型和表达系统，通常在24-72小时后更换新鲜培养基，以去除转染试剂残留。

3.诱导表达：在适宜的诱导条件下表达抗原。对于重组蛋白，常用的诱导剂是IPTG，浓度通常为0.2-0.5mM；对于某些病毒载体系统，可能需要调整培养条件（如温度、培养基成分）。诱导时间需通过实验确定最佳表达时间点。

4.表达后，收集细胞培养上清液，作为抗原粗提物。

（二）抗原纯化步骤

1.初步纯化（如亲和层析）：

(1)选择合适的亲和层析介质，例如：

-若抗原含有特定标签（如His-tag），使用Ni-NTA树脂。上样前需用含咪唑的缓冲液（如20-50mM咪唑）平衡层析柱。

-若抗原具有特定抗体结合位点，使用相应的抗体亲和介质。上样前需用结合缓冲液（低离子强度）平衡层析柱。

(2)将粗提物过柱，流速控制在适宜范围（通常为树脂体积的1-5倍/小时）。

(3)用洗涤缓冲液（不含或低浓度咪唑/结合剂）洗涤层析柱，去除未结合的杂质。

(4)用洗脱缓冲液（高浓度咪唑/高浓度结合剂）洗脱目标抗原，收集洗脱液。

(5)收集的洗脱液可通过SDS初步检测纯度。

2.高度纯化（如反相高效液相色谱RP-HPLC）：

(1)将初步纯化的抗原溶液过0.45μm滤膜除菌。

(2)将样品上样至反相HPLC柱（如C4或C8柱），使用合适的梯度洗脱程序（如线性梯度，从低到高洗脱剂强度）。

(3)收集目标纯化峰，通过UV检测器（如254nm或280nm）监测。

(4)对收集的组分进行SDS和/或WesternBlotting分析，确认单一性和纯度，计算纯化后的回收率。

（三）抗原质量检测

1.SDS检测纯度：使用预染蛋白Marker和标准品，评估主峰纯度（通常要求≥95%）。

2.抗原效价/活性测定：

(1)采用特异性ELISA（酶联免疫吸附测定）检测抗原浓度和特异性。

(2)采用体外细胞培养法（如基于细胞的免疫学测定，CBIA）或动物模型测定抗原的半数有效量（ED50），评估其免疫原活性。

(3)对于多肽或小分子抗原，可能还需进行结构确证（如质谱、核磁共振，如果适用且必要）。

3.稳定性测试：取纯化后的抗原样品，置于不同条件（如37℃、4℃、-20℃）下，定期检测其效价和纯度，评估稳定性。

五、疫苗制剂配制

（一）佐剂选择与配制

1.选择合适的佐剂类型，如氢氧化铝（Alum，Al(OH)₃）或水包油乳剂佐剂（如MF59）。本规程以氢氧化铝为例。

2.使用符合药典标准的氢氧化铝佐剂，其粒度分布需符合要求（如家兔精制氢氧化铝佐剂，粒度分布通常在0.5-5μm）。

3.按照预定处方，将氢氧化铝佐剂用注射用水或无菌生理盐水配制成所需浓度（如0.25-0.5mg/mL）。

4.配制过程中需进行搅拌，确保混合均匀。使用前需检查pH值，通常控制在4.0-6.0之间。

5.配制好的佐剂溶液需进行无菌过滤（如0.22μm滤膜），分装于无菌西林瓶中，封口并灭菌（如采用巴氏消毒法62℃，30分钟；或高压蒸汽灭菌，需验证对佐剂稳定性的影响）。

（二）抗原与佐剂混合

1.按照验证确定的处方比例（如抗原：佐剂=1:1w/w或v/v），在无菌条件下将抗原溶液与佐剂溶液混合。

2.混合方式：使用无菌搅拌器或涡旋振荡器，确保混合均匀。混合时间需通过实验确定，通常为1-5分钟。

3.混合后立即检查物理状态，确保无可见颗粒、分层或变色。如有必要，可进行短暂的搅拌或超声处理（功率和时间需验证），但需注意避免产生气泡或破坏抗原结构。

4.混合后的疫苗原液需尽快进行分装，或低温（如4℃）保存，待后续分装。

（三）最终制剂配制

1.防腐剂添加：根据验证结果，在无菌条件下向疫苗原液中加入适量的防腐剂，如苯酚（最终浓度通常为0.001%-0.002%）。需确保防腐剂在最终产品中的浓度符合药典要求且不影响疫苗效力。苯酚需使用高纯度产品，并注意其颜色和气味。

2.等渗调节：如果疫苗最终产品需要调节渗透压至与体液接近，需在此步骤加入等渗调节剂（如氯化钠、葡萄糖），使用无菌注射用水配制，并通过渗透压仪或冰点渗透压计进行检测，确保最终产品渗透压符合要求（如±5mOsm/kg）。

3.灭菌处理：根据最终产品的稳定性数据和法规要求，选择合适的灭菌方法。

(1)巴氏消毒法：适用于对热敏感的疫苗组分，通常采用62℃、30分钟或72℃、15秒的工艺，需验证对疫苗效力、稳定性和pH的影响。

(2)高压蒸汽灭菌：适用于对热稳定的疫苗组分，温度通常为121℃、15-20分钟，需验证对疫苗效力、稳定性和pH的影响。

4.pH调节：灭菌后，再次检查并调整pH值，确保在规定范围内（如注射用疫苗通常要求pH4.0-8.0）。

5.包装与封口：将配制好的疫苗原液无菌分装至西林瓶中，使用无菌橡胶塞和铝盖封口。封口过程需确保无菌屏障完整。

六、质量控制

（一）无菌检测

1.所有无菌操作环节（如细胞培养、纯化、分装）均需在符合GMP要求的环境（如生物安全柜、超净工作台）中进行，并使用无菌耗材和工具。

2.最终成品需进行无菌检验，采用薄膜过滤法将样品接种至合适的液体培养基（如TSA、SMA）和固体培养基（如TSA、PCA），置于37℃培养3-5天，观察是否有菌生长。需设置阴性对照。

3.同时，需进行无菌性对照测试，例如使用已知无菌的对照溶液或培养基进行相同的操作流程，以排除操作本身引入污染的可能性。

4.对于原液、半成品等中间产品，同样需按批次进行无菌检验。

（二）内毒素检测

1.所有终产品（如原液、半成品，根据法规要求）均需进行内毒素（热原）检测。

2.采用鲎试验法（LAL法）进行检测，可使用凝胶法或浊度法。样品需经过适当处理（如过滤），确保无干扰物质。

3.检测结果需符合预定标准（如≤0.25EU/mL）。需设置阴性对照。

4.对于可能干扰LAL试验的组分（如高浓度蛋白），可能需要进行样品稀释或采用其他验证过的方法。

（三）效力检验

1.效力检验是评估疫苗是否达到预期免疫效果的关键指标。

2.体外细胞培养法：建立基于细胞的免疫学测定（CBIA）方法，检测疫苗样品中抗原的特异性刺激能力，计算半数效价（ED50），评估抗原含量和活性。

3.体内免疫原性试验：

(1)选择合适的动物模型（如小鼠、大鼠），建立标准的免疫程序（如免疫途径、剂量、免疫次数）。

(2)免疫后特定时间点（如14天、28天）采集动物血清，采用特异性ELISA或动物模型保护实验等方法，评估免疫应答水平（如抗体滴度、细胞因子产生、保护率等）。

(3)需设置空白对照（未免疫）、阴性对照（安慰剂佐剂）和阳性对照（已知效力的疫苗或免疫原）。

4.效力检验结果需达到预定的标准，并与已验证的参考标准进行比较。

七、放行标准

（一）符合所有预定的生产工艺参数：所有生产批次的操作记录（如培养日志、纯化数据、配制记录、灭菌参数等）需完整、准确，并与规程要求一致，无重大偏差。

（二）所有检验项目结果均符合规定标准：包括原材料检验、过程检验（如细胞活力、纯化收率）、成品检验（无菌、内毒素、效力）等所有项目的检测结果均需在预定的可接受范围内。

（三）批生产记录完整，无重大偏差或失败：所有批生产记录需经审核，确认无遗漏、错误，且生产过程中未发生影响产品质量的重大事件。

（四）包装与标签符合要求：疫苗的包装材料需符合无菌、无反应原等要求，标签信息（如品名、批号、有效期、储存条件等）需准确、清晰、完整，并符合相关规范。

（五）稳定性数据支持：当批次产品完成后，需有相应的稳定性考察数据支持，证明该批次产品在预期储存条件下能够保持质量至少至有效期。

八、文件记录

（一）生产记录

1.细胞培养日志：详细记录每批次细胞的复苏、传代、冻存、复苏等所有操作信息，包括日期、操作人、细胞名称、接种密度、生长状态、冻存/复苏时间/条件等。

2.纯化记录：详细记录每批次抗原纯化的所有步骤，包括上样量、流速、平衡缓冲液、洗脱缓冲液、梯度程序、收集时间、各管体积、纯化后SDS或HPLC结果、回收率计算等。

3.配制记录：详细记录每批次疫苗制剂配制的所有步骤，包括称量、溶解、混合、过滤、分装、灭菌、pH调节等所有操作参数，记录所用物料批号、操作人、设备校验信息等。

4.设备校准记录：所有用于生产的关键设备（如生物安全柜、超净工作台、离心机、层析柱、灭菌设备、pH计、天平、匀浆机等）需定期进行校准，并记录校准日期、结果和状态。

（二）检验记录

1.原材料检验报告：每批原材料的检验报告均需存档，包括检验项目、标准、结果和结论。

2.成品检验报告：每批成品的检验报告（无菌、内毒素、效力等）均需存档，作为产品放行的依据。

3.过程检验记录：生产过程中的关键控制点（如细胞活力、纯化峰纯度、佐剂pH等）的检验记录需完整存档。

4.稳定性考察报告：所有稳定性考察的数据和报告需存档。

（三）变更控制

1.变更通知单（CNC）：任何对规程、处方、工艺、设备、物料等的变更，均需填写变更通知单，详细说明变更原因、内容、评估、验证计划和结果。变更需经过授权人员批准后方可执行。

2.变更验证报告：每项变更需进行验证，验证报告需证明变更后的工艺或产品仍能满足质量标准。验证项目通常包括：无菌、内毒素、效力、稳定性、安全性（如适用）等。

3.验证后的规程更新：经批准的验证结果需及时更新到相应的操作规程中，并通知相关人员。所有变更和验证文件需存档。

一、概述

免疫学疫苗研制操作规程是确保疫苗安全、有效生产的关键流程。本规程旨在规范疫苗研制的各个阶段，包括原材料准备、细胞培养、抗原纯化、佐剂添加、疫苗制剂配制、质量控制和放行等环节。遵循本规程有助于降低生产风险，提高疫苗质量，保障公众健康。

二、原材料准备

（一）原材料选择

1.细胞培养基：选择符合GMP标准的细胞培养基，如DMEM或F12培养基，确保pH值在7.2-7.4之间。

2.胰蛋白酶：使用高纯度胰蛋白酶进行细胞消化，浓度控制在0.25%±0.02%。

3.血清：采用胎牛血清（FBS），纯度≥95%，需经过无菌过滤和热灭活处理。

（二）原材料检验

1.每批原材料需进行无菌、内毒素、纯度及效价检测。

2.细胞培养基需检测pH值、电导率、渗透压等指标。

3.血清需进行支原体检测，确保无污染。

三、细胞培养

（一）细胞复苏

1.将冻存细胞置于37℃水浴中解冻，迅速加入预温培养基。

2.解冻后立即接种于T75培养瓶，初始密度控制在1×10^5-2×10^5cells/mL。

（二）细胞传代

1.当细胞融合率达80%-90%时，用胰蛋白酶消化。

2.用PBS缓冲液洗涤2次，弃去旧培养基，加入新鲜培养基。

（三）细胞培养过程监控

1.每日观察细胞生长状态，记录形态变化。

2.每周检测细胞活力，确保≥95%。

3.定期进行支原体检测，防止污染。

四、抗原纯化

（一）抗原表达

1.将编码抗原的重组质粒转染细胞，培养48小时后诱导表达。

2.诱导条件：异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）浓度0.2-0.5mM，温度37℃。

（二）抗原纯化步骤

1.初步纯化：采用镍柱亲和层析，洗脱液为咪唑梯度（0-0.5M）。

2.高度纯化：使用反相高效液相色谱（RP-HPLC），检测峰纯度≥95%。

（三）抗原质量检测

1.SDS检测纯度，计算回收率。

2.西门子乳胶凝集试验检测抗原效价，效价≥1:128为合格。

五、疫苗制剂配制

（一）佐剂选择与配制

1.使用氢氧化铝佐剂，浓度0.25-0.5mg/mL。

2.将佐剂用注射用水配制成等渗溶液，渗透压±5mOsm/kg。

（二）抗原与佐剂混合

1.按比例（抗原:佐剂=1:1）混合，使用涡旋振荡器充分乳化。

2.混合后静置30分钟，观察无沉淀或分层。

（三）最终制剂配制

1.加入防腐剂苯酚，终浓度0.001%-0.002%。

2.灭菌处理：采用巴氏消毒法（62℃，30分钟）。

六、质量控制

（一）无菌检测

1.制剂需进行薄膜过滤法检测，菌落计数≤10CFU/mL。

2.使用黑曲霉和枯草芽孢杆菌进行孢子污染检测。

（二）内毒素检测

1.采用鲎试验法检测，内毒素含量≤0.25EU/mL。

2.每批制剂需重复检测3次，确保结果一致。

（三）效力检验

1.体外细胞培养法检测抗原活性，半数效价（ED50）≥1×10^7IU/mL。

2.小鼠免疫原性试验，免疫后14天血清抗体滴度≥1:2560。

七、放行标准

（一）符合所有预定的生产工艺参数。

（二）所有检验项目结果均符合规定标准。

（三）批生产记录完整，无重大偏差。

（四）包装与标签符合GMP要求。

八、文件记录

（一）生产记录

1.每批生产需记录细胞培养日志、纯化数据、配制过程参数。

2.记录设备校准信息，包括灭菌锅、离心机等。

（二）检验记录

1.保存所有检验报告，包括无菌、内毒素、效力检测数据。

2.建立批放行审核表，由QA部门签字确认。

（三）变更控制

1.任何原材料或工艺变更需填写变更通知单，经批准后方可执行。

2.变更后需重新进行稳定性考察，确保不影响疫苗质量。

**一、概述**

免疫学疫苗研制操作规程是确保疫苗安全、有效生产的关键流程。本规程旨在规范疫苗研制的各个阶段，包括原材料准备、细胞培养、抗原纯化、佐剂添加、疫苗制剂配制、质量控制和放行等环节。遵循本规程有助于降低生产风险，提高疫苗质量，保障公众健康。本规程适用于所有涉及疫苗生产的核心操作活动，是人员培训、过程监控和合规性审查的基础文件。

二、原材料准备

（一）原材料选择

1.细胞培养基：选择符合GMP标准的细胞培养基，如DMEM或F12培养基，确保pH值在7.2-7.4之间。培养基需经过质量评估，包括无菌、无支原体、无致热原（内毒素）和无明显细胞毒性。储存条件为2-8℃，避光保存，有效期根据供应商建议确定，通常为1-2年。使用前需进行复溶、过滤除菌（通常使用0.22μm滤膜）和温度平衡至37℃。

2.胰蛋白酶：使用高纯度胰蛋白酶进行细胞消化，浓度控制在0.25%±0.02%（w/v）。胰蛋白酶需经过无菌检验、内毒素检验和活性测定。储存于-20℃或更低温度，避免反复冻融。使用时需用无Ca²⁺、Mg²⁺的缓冲液（如D-Hanks或PBS）进行适当稀释，并严格控制作用时间（通常为1-5分钟，需通过实验确定最佳时间），以防止细胞过度消化。

3.血清：采用胎牛血清（FBS），纯度≥95%，需经过无菌过滤（0.1μm或0.22μm）和热灭活处理（56℃，30分钟）。血清需进行支原体检测、内毒素检测、蛋白含量测定和效价评估（如对特定病毒的抗体会影响疫苗效力）。储存于-20℃或更低温度，分装使用。建议优先使用低IgG含量的FBS，以减少对后续纯化的影响。

（二）原材料检验

1.每批原材料需进行严格的检验，包括：

(1)无菌检验：采用培养法（如薄膜过滤法接种至合适的液体培养基和固体培养基）检测是否存在微生物污染。

(2)内毒素检验：采用鲎试验法（LAL法）检测样品中的内毒素水平，确保符合预定标准（通常≤0.25EU/mL）。

(3)纯度分析：如适用，通过SDS、HPLC等方法评估原料的纯度。

(4)效价/活性测定：如适用，例如对于酶或生长因子，需测定其活性单位。

2.细胞培养基需检测关键理化指标：

(1)pH值：使用精密pH计检测。

(2)电导率：反映培养基中的离子强度，使用电导率仪检测。

(3)渗透压：使用渗透压计检测，确保与体液接近。

(4)无菌过滤后需再次检测内毒素和微生物。

3.血清需进行特殊检测：

(1)支原体检测：采用特异性支原体检测方法（如PCR或培养法）。

(2)细胞毒性测试：使用正常细胞进行测试，确保血清对目标细胞无毒性。

(3)免疫原性评估：如有可能，评估其对后续免疫应答的影响。

三、细胞培养

（一）细胞复苏

1.将冻存细胞（如冻存管）置于37℃水浴中解冻，迅速加入预温（37℃）的适量培养基（通常为5-10mL），轻轻吹打混匀，避免剧烈摇晃。

2.解冻后立即接种于T75培养瓶中，初始接种密度根据细胞类型和生长特性优化确定，通常为1×10^5-2×10^5cells/mL。加入培养基至总容量约80-90%。

（二）细胞传代

1.观察细胞生长状态，当细胞融合率达80%-90%时，准备进行传代。

2.用预温的PBS缓冲液（37℃）洗涤细胞2次，每次5-10分钟，弃去旧培养基。

3.加入适量预温的胰蛋白酶（按所需消化面积和细胞密度计算用量），置于37℃、5%CO₂培养箱中消化。通过观察显微镜下细胞收缩、变圆来判断消化程度，通常为1-5分钟，具体时间需根据细胞类型和状态优化。

4.当细胞大部分变圆时，加入含血清的培养基终止消化（通常加入培养基体积为胰蛋白酶体积的3-5倍）。

5.用PBS缓冲液洗涤2次，弃去旧培养基，加入新鲜培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。

（三）细胞培养过程监控

1.每日观察细胞生长状态，包括：

(1)形态学：细胞是否贴壁、生长是否均匀、有无异常形态（如多核细胞、空泡、出血等）。

(2)融合度：记录细胞融合百分比。

(3)污染监控：注意有无微生物污染迹象（如培养基浑浊、有漂浮物、颜色改变等）。

2.每周检测细胞活力，采用台盼蓝染色法或MTT法，确保细胞活力≥95%。

3.定期（如每月或每季度）进行支原体检测，对检测到的阳性样品需进行溯源、处理和验证，防止交叉污染。

4.记录所有观察数据和检测结果，存档备查。

四、抗原纯化

（一）抗原表达

1.将编码抗原的重组质粒通过合适的转染方法（如脂质体法、电穿孔法）转染到宿主细胞中。转染效率需通过预实验进行优化。

2.转染后，根据细胞类型和表达系统，通常在24-72小时后更换新鲜培养基，以去除转染试剂残留。

3.诱导表达：在适宜的诱导条件下表达抗原。对于重组蛋白，常用的诱导剂是IPTG，浓度通常为0.2-0.5mM；对于某些病毒载体系统，可能需要调整培养条件（如温度、培养基成分）。诱导时间需通过实验确定最佳表达时间点。

4.表达后，收集细胞培养上清液，作为抗原粗提物。

（二）抗原纯化步骤

1.初步纯化（如亲和层析）：

(1)选择合适的亲和层析介质，例如：

-若抗原含有特定标签（如His-tag），使用Ni-NTA树脂。上样前需用含咪唑的缓冲液（如20-50mM咪唑）平衡层析柱。

-若抗原具有特定抗体结合位点，使用相应的抗体亲和介质。上样前需用结合缓冲液（低离子强度）平衡层析柱。

(2)将粗提物过柱，流速控制在适宜范围（通常为树脂体积的1-5倍/小时）。

(3)用洗涤缓冲液（不含或低浓度咪唑/结合剂）洗涤层析柱，去除未结合的杂质。

(4)用洗脱缓冲液（高浓度咪唑/高浓度结合剂）洗脱目标抗原，收集洗脱液。

(5)收集的洗脱液可通过SDS初步检测纯度。

2.高度纯化（如反相高效液相色谱RP-HPLC）：

(1)将初步纯化的抗原溶液过0.45μm滤膜除菌。

(2)将样品上样至反相HPLC柱（如C4或C8柱），使用合适的梯度洗脱程序（如线性梯度，从低到高洗脱剂强度）。

(3)收集目标纯化峰，通过UV检测器（如254nm或280nm）监测。

(4)对收集的组分进行SDS和/或WesternBlotting分析，确认单一性和纯度，计算纯化后的回收率。

（三）抗原质量检测

1.SDS检测纯度：使用预染蛋白Marker和标准品，评估主峰纯度（通常要求≥95%）。

2.抗原效价/活性测定：

(1)采用特异性ELISA（酶联免疫吸附测定）检测抗原浓度和特异性。

(2)采用体外细胞培养法（如基于细胞的免疫学测定，CBIA）或动物模型测定抗原的半数有效量（ED50），评估其免疫原活性。

(3)对于多肽或小分子抗原，可能还需进行结构确证（如质谱、核磁共振，如果适用且必要）。

3.稳定性测试：取纯化后的抗原样品，置于不同条件（如37℃、4℃、-20℃）下，定期检测其效价和纯度，评估稳定性。

五、疫苗制剂配制

（一）佐剂选择与配制

1.选择合适的佐剂类型，如氢氧化铝（Alum，Al(OH)₃）或水包油乳剂佐剂（如MF59）。本规程以氢氧化铝为例。

2.使用符合药典标准的氢氧化铝佐剂，其粒度分布需符合要求（如家兔精制氢氧化铝佐剂，粒度分布通常在0.5-5μm）。

3.按照预定处方，将氢氧化铝佐剂用注射用水或无菌生理盐水配制成所需浓度（如0.25-0.5mg/mL）。

4.配制过程中需进行搅拌，确保混合均匀。使用前需检查pH值，通常控制在4.0-6.0之间。

5.配制好的佐剂溶液需进行无菌过滤（如0.22μm滤膜），分装于无菌西林瓶中，封口并灭菌（如采用巴氏消毒法62℃，30分钟；或高压蒸汽灭菌，需验证对佐剂稳定性的影响）。

（二）抗原与佐剂混合

1.按照验证确定的处方比例（如抗原：佐剂=1:1w/w或v/v），在无菌条件下将抗原溶液与佐剂溶液混合。

2.混合方式：使用无菌搅拌器或涡旋振荡器，确保混合均匀。混合时间需通过实验确定，通常为1-5分钟。

3.混合后立即检查物理状态，确保无可见颗粒、分层或变色。如有必要，可进行短暂的搅拌或超声处理（功率和时间需验证），但需注意避免产生气泡或破坏抗原结构。

4.混合后的疫苗原液需尽快进行分装，或低温（如4℃）保存，待后续分装。

（三）最终制剂配制

1.防腐剂添加：根据验证结果，在无菌条件下向疫苗原液中加入适量的防腐剂，如苯酚（最终浓度通常为0.001%-0.002%）。需确保防腐剂在最终产品中的浓度符合药典要求且不影响疫苗效力。苯酚需使用高纯度产品，并注意其颜色和气味。

2.等渗调节：如果疫苗最终产品需要调节渗透压至与体液接近，需在此步骤加入等渗调节剂（如氯化钠、葡萄糖），使用无菌注射用水配制，并通过渗透压仪或冰点渗透压计进行检测，确保最终产品渗透压符合要求（如±5mOsm/kg）。

3.灭菌处理：根据最终产品的稳定性数据和法规要求，选择合适的灭菌方法。

(1)巴氏消毒法：适用于对热敏感的疫苗组分，通常采用62℃、30分钟或72℃、15秒的工艺，需验证对疫苗效力、稳定性和pH的影响。

(2)高压蒸汽灭菌：适用于对热稳定的疫苗组分，温度通常为121℃、15-20分钟，需验证对疫苗效力、稳定性和pH的影响。

4.pH调节：灭菌后，再次检查并调整pH值，确保在规定范围内（如注射用疫苗通常要求pH4.0-8.0）。

5.包装与封口：将配制好的疫苗原液无菌分装至西林瓶中，使用无菌橡胶塞和铝盖封口。封口过程需确保无菌屏障完整。

六、质量控制

（一）无菌检测

1.所有无菌操作环节（如细胞培养、纯化、分装）均需在符合GMP要求的环境（如生物安全柜、超净工作台）中进行，并使用无菌耗材和工具。

2.最终成品需进行无菌检验，采用薄膜过滤法将样品接种至合适的液体培养基（如TSA、SMA）和固体培养基（如TSA、PCA），置于37℃培养3-5天，观察是否有菌生长。需设置阴性对照。

3.同时，需进行无菌性对照测试，例如使用已知无菌的对照溶液或培养基进行相同的操作流程，以排除操作本身引入污染的可能性。

4.对于原液、半成品等中间产品，同样需按批次进行无菌检验。

（二）内毒素检测

1.所有终产品（如原液、半成品，根据法规要求）均需进行内毒素（热原）检测。

2.采用鲎试验法（LAL法）进行检测，可使用凝胶法或浊度法。样品需经过适当处理（如过滤），确保无干扰物质。

3.检测结果需符合预定标准（如≤0.25EU/mL）。需设置阴性对照。

4.对于可能干扰LAL试验的组分（