DB53-T 447.5-2022云岭牛 第5部分：体外胚胎生产

ICS65.020.3053CCSB4353云 南 省 地 方 标 准DB53/T447.5—2022代替DB53/T447.5-2012云岭牛第5部分：体外胚胎生产2022-05-202022-05-20发布2022-08-20实施云南省市场监督管理局  发布DB53/T447.5DB53/T447.5—2022前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件为DB53/T447—2022《云岭牛》的第5部分。DB53/T447已经发布了以下部分：——第1部分：品种；——第2部分：养殖场建设规范；34——第5部分：体外胚胎生产；——第6部分：饲养管理；——第7部分：饲草加工与调制技术；89——第10部分：档案管理；——第11部分：胴体生产、评定及分割技术。本文件代替DB53/T447.5-2012《BMY牛第5部分：体外胚胎生产》，与DB53/T447.5-2012相BMY（3）；（4.3）；更改了“采卵装置和器具”中部分表述（6.1.1.1），删除“酒精棉球”（2012（6.1.2）；（6.1.3）；6.2.1）；（6.2.3）；（7.1）；（7.2.1）；（10.2.1、10.2.2）。（YNTC07）——2012年首次发布；——本次为第一次修订。IDB53/T447.5DB53/T447.5—2022引 言DB53/T447-20222014年12户）DB53/T447-2022由十一个部分构成。12345IVMIVFIVC67（碱）化饲料、青干草饲料的加工调制技术要求。——第8部分：育肥技术。目的在于确立云岭牛优质牛肉生产和雪花牛肉生产技术要求。91011DB53/T447-2022IIIDB53/T447.5DB53/T447.5—2022DB53/T447.5DB53/T447.5—2022云岭牛第5部分：体外胚胎生产范围本文件适用于牛体外胚胎生产和移植技术操作。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。DB53/T447云岭牛第4部分：胚胎移植术语和定义3.1活体采卵ovumpickup3.1活体采卵ovumpickup借助超声波探测器或内窥镜，直接从供体牛活体卵巢中采集（吸取）未成熟的卵母细胞。3.2体外受精invitrofertilization（Invitromaturation，IVM）（Invitrofertilization，IVF）和受精卵的体外发育培养（Invitroculture，IVC）。3.3体外胚胎生产invitroembryoproduction。4设施、仪器及器具、耗材主要设施胚胎工程实验室、采卵室、分牛栏、保定架等。主要仪器超净工作台、超纯水仪、高压灭菌仪、干热灭菌仪、EO灭菌仪、超低温冰箱、电冰箱、电子天平、倒置显微镜、实体显微镜、CO2培养箱、活体采卵装置、胚胎冷冻仪、恒温台、水浴锅、细胞(胚胎)培养运输仪、液氮罐、pH测定仪、封口机等。主要器具、耗材1硅化瓶、烧杯、量筒、过滤灭菌滤器（0.22µum，0.45µm）、酒精灯、离心管（10mL或15mL、50mL）、培养皿、注射器（1mL、5mL、10mL、20mL、50mL）、检卵器或微细玻璃管、巴氏玻璃管、记号笔、计时器；过滤式集卵（胚）杯、手术器具一套（毛剪、止血钳、镊子等）、塑料细管专用剪、塑料细管（0.25mL）、胚胎解冻杯和温度计、胚胎移植枪、移植枪加外套和保护膜、75%酒精棉球等。供体牛的选择与饲养管理供体牛的选择参照DB53/T447.4的规定执行。供体牛的饲养管理参照DB53/T447.4的规定执行。卵母细胞的获取获取方式从活体供体牛卵巢中采集（活体采卵）或从屠宰后母牛离体卵巢中采集卵母细胞。活体采卵（OPU）采卵前的准备装置和器具B型超声波扫描仪、扇形阴道探头（7.5MHz）、真空泵和恒温器；16G、17G、18G金属采卵针、回收管、50mL离心管（集收杯）、一次性注射器（5mL、10mL）等。麻醉剂麻醉剂2%利多卡因或普鲁卡因。采卵液D-PBS+10IU/mL肝素钠+1FCS+青霉素100IU/mL100μg/mL链霉素。采卵装置的调试供体牛的保定与麻醉按DB53/T447.4的规定执行。采卵按以下步骤采卵：BB将吸满采卵液的单腔采卵针插入装在探头上的采卵针筒中；BB（针头刺穿阴道壁2和卵泡壁（37C恒温）；2mm～8mm；80mmHg～85mmHg。6.2.3采卵频率根据实际需要可采用每周1次～2次、每月一次或在母牛集中配种前随机选择，批量采卵。从屠宰后母牛离体卵巢中采集卵母细胞主要材料保温箱（壶）、止血钳、手术剪、乳胶手套、注射器、针头、离心管、注射器用灭菌过滤器（0.25μm）等。卵巢保存液灭菌的PBS液或生理盐水+100mg硫酸卡那霉素。卵巢的收集母牛屠宰后30min内采集卵巢，用卵巢保存液冲洗2～333C保存液的保温瓶内保存，尽快带回实验室。卵母细胞的吸取按以下步骤进行卵母细胞的吸取：PBS100mL10010mg33C2～3（含量0.3%BSABO（9.1.1）33C18G20G10mL2mm～8mm15mL50mL离心管内置于恒温槽待检卵和分类。卵母细胞的检出与分级卵母细胞的检出按以下步骤检出卵母细胞：5%～10%CSFCSPBS3～4在实体显微镜下检出卵母细胞，如使用带有侧滤网的胚胎滤杯，则可直接在其中检卵；1～（CumulusoocytecomplexesCOCs）PBS卵母细胞的分级与选用4（Thecumulusoocytescomplexes，COCs）完整为Ⅰ级。33COCs1～2COCs卵母细胞质色泽基本均匀，卵丘细胞扩散或半裸、裸卵和闭锁卵为Ⅳ级。选择Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级卵母细胞用于体外成熟培养。卵母细胞的体外成熟培养（IVM）体外成熟培养液的配制TCM-199（19mL）+CS或FCS1mL+FSH20l（0.1g/mL）或E21g/mL+抗菌素20l（青霉素10万IU/mL、链霉素100mg/mL），过滤灭菌后备用。COCs的清洗与体外成熟培养（IVM）按以下步骤进行COCs的清洗与体外成熟培养（IVM）：IVM35mm100l3～44油，在C220mi；COs用IVM液洗涤315～205%C9522h。卵母细胞的体外受精（IVF）精子的制备与获能处理精子的制备与获能处理BO液的配制（修正）BO（修正）AB9.11.2A液：Nal4.092g+KCl0.174g+CaC20.171g+NaPO40.840g+Mgl20.697g+0.5%酚红0.1mL+超纯净水500mL。BNaHO2.573g+0.50.04mL+200mLCO230mn作气相平衡。A76mLB24mL0.1375g100L（10IU/mL，链霉100mg/mL）130L，过滤灭菌后冷藏保存。精子清洗液配制BO液50mL+咖啡因10mmol/L，过滤灭菌。精子稀释液配制BO液10mL+BSA（牛血清白蛋白）0.06g，过滤灭菌。精子制备与获能按以下步骤进行精子制备与获能：37C～38C10s7mL1800r.p.m.5min；1mL～2mL1mL1mL/mL；495l5L100L在5%C、9538.5C1h1.5h。9.2卵母细胞的体外受精（IVF）IVM22h的COCs用卵母细胞清洗液洗涤3100L（每滴15枚～2），在5%C95%38.55h。受精卵的体外发育培养（IVC）IVC培养液（m-CR1aa）的配制NaCl0.67g+KCl0.023g+NaHCO30.22g+半乳酸钙0.055g+丙酮酸钠0.004g+谷氨酰胺0.015g+酚红0.0005g+必需氨基酸1mL+非必需氨基酸1mL+超纯净水100mL+抗菌素100l（青霉素10万IU/mL，链霉素100mg/mL），过滤灭菌，分装待用。受精卵的清洗和体外发育培养按以下步骤进行受精卵的清洗和体外发育培养：m-CR1aa35mm41h；5%CSm-CR1aa3培养皿或盛有m-CR1aa培养液的4孔培养皿中，每滴（孔）