DB15∕T 2033-2020 乳酸菌胞外多糖的分离纯化与鉴定技术规程

ICS65.020.30

CCSB44

DB15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T2033—2020

乳酸菌胞外多糖的分离纯化

与鉴定技术规程

Thetechnicalspecificationforseparation,purificationandidentificationof

lactobacillusextracellularpolysaccharides

2020-11-30发布2020-12-30实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T2033—2020

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由内蒙古自治区农牧业科学院提出。

本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。

本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古大学。

本文件主要起草人：杜瑞平、王潇、高民、修磊、盛守新、张昊池、潘娜、马燕芬、羿静。

I

DB15/T2033—2020

乳酸菌胞外多糖的分离纯化

与鉴定技术规程

1范围

本文件规定了乳酸菌胞外多糖的提取、分离、纯化与鉴定的方法与技术流程。

本文件适用于乳酸菌胞外多糖的提取、分离、纯化及鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T32198红外光谱定量分析技术通则

GB/T36240离子色谱仪

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

乳酸菌lacticacidbacteria(LAB)

一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸、无芽孢、革兰氏染色细菌的总称。

3.2

乳酸菌胞外多糖lacticacidbacteriaexopolysaccharide(LABEPS）

乳酸菌在生长代谢过程中合成并分泌于细胞外或渗入培养基中的多糖及其混合物。

3.3

硫酸-苯酚法sulfuricacid-phenolmethod

利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合

物，再以比色法测定。

3.4

离子交换层析ion-exchangechromatography(IEC)

在一定pH条件下，根据被分离样品所带电荷不同而进行的分离方法。可根据样品性质来选择合适

的离子交换介质。

3.5

凝胶层析gelfiltrationchromatography

1

DB15/T2033—2020

按照样品分子量大小进行分离的技术，又称凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析。通常使用Superdex、

Surperose、Sephacryl、Sepharose、Sephadex等凝胶纯化介质。

3.6

紫外光谱ultravioletandvisiblespectrum(UV)

测定物质分子在紫外光区吸收光谱的分析方法。一般的紫外光谱是指近紫外区（200nm～380nm）

的吸收光谱。

3.7

红外光谱infraredspectroscopy(IR）

分子能选择性吸收某些波长的红外线，检测红外线被吸收的情况可得到物质的红外吸收光谱，又称

分子振动光谱或振转光谱。通常所说的红外光谱即指中红外光谱（2.5μm～25μm）。

3.8

离子色谱ionchromatography

高效液相色谱(HPLC)的一种，是利用被测物质的离子性分离和检测阴离子和阳离子的一种液相色谱

方法。

4材料、仪器和试剂

4.1菌株材料

分离、保存并鉴定的乳酸菌菌株。

4.2仪器

数显电热水浴锅，高压蒸汽灭菌锅，生化培养箱，超高速低温离心机，真空低温冷冻干燥机，荧光

倒置显微镜，高效液相色谱仪，蛋白核酸纯化系统，离子色谱仪，红外光谱仪，多角度激光检测器。

4.3试剂与耗材

4.3.1试剂

MRS固体培养基，MRS液体培养基,无水乙醇、三氯乙酸、三羟甲基氨基甲烷、氢氧化钠、葡萄糖、

浓硫酸、浓盐酸、冰醋酸、无水乙酸钠、氯化钠等均为分析纯。

4.3.2耗材

DEAESepharoseFastFlow，SepharoseCL-6B，ColumnXK26/40、ColumnXK16/100层析柱，透析

袋（截留量8K～12KDa）。

4.3.3多糖标准品

葡萄糖胺，阿拉伯糖，半乳糖，葡萄糖，甘露糖，葡萄糖醛酸。

2

DB15/T2033—2020

5测定步骤

5.1乳酸菌粗多糖的提取

5.1.1活化培养

MRS固体培养基活化乳酸菌，挑取单菌落至MRS液体培养基中，厌氧条件下，37℃培养20h。按4%

（v/v）接种量接种到适量MRS液体培养基中，厌氧条件下37℃培养30h。将发酵后的菌液5000rpm、4℃

条件下离心15min，弃去沉淀，收集上清。

5.1.2三氯乙酸处理

上清液中缓慢加入浓度为800mg/mL三氯乙酸，使其终浓度为40mg/mL，4℃静置8h后10000rpm、

4℃条件下离心10min，弃去沉淀，收集上清。

5.1.3无水乙醇处理

按1:4的体积比向上清液中加入无水乙醇，4℃过夜，10000rpm、4℃条件下离心10min后收集底

部沉淀。将沉淀溶于60℃蒸馏水中，10000rpm离心10min，弃去底部不溶沉淀，收集上清。

5.1.4透析

将上清液装入截留分子量为8KDa的透析袋内，透析2h～4h后，更换透析液，之后每6h～8h

更换一次透析液，连续透析2d。收集透析袋内多糖溶液，真空冷冻干燥制得乳酸菌粗多糖。

5.2粗多糖纯化

5.2.1离子交换纯化

5.2.1.1层析柱处理

将DEAE-SepharoseFastFlow填料装填于ColumnXK26/40（内径：26mm，高度400mm）层析柱中，

体积为150mL，用Tris-HCl溶液（55mM，pH7.5～7.8）以1.5mL/min流速过夜平衡层析柱。

5.2.1.2纯化

将粗多糖溶于Tris-HCl中，配成浓度为10mg/mL溶液，0.22μm滤膜过滤后上样。流动相使用

Tris-HCl和含1MNaCl的Tris-HCl洗脱液，将蛋白质核酸纯化系统的流速设置为2.0mL/min，每3min

收集一次洗脱液至试管中。

5.2.1.3洗脱曲线绘制

用硫酸-苯酚法测定洗脱液中多糖含量，在490nm处检测吸光值，绘制洗脱曲线。

5.2.2分子筛纯化

5.2.2.1层析柱处理

3

DB15/T2033—2020

将SepharoseCL-6B装填于ColumnXK16/100（内径：16mm，高度1000mm）层析柱中，体积为150

mL，用Tris-HCl溶液（55mM，pH7.5～7.8）以0.5mL/min流速过夜平衡层析柱。

5.2.2.2纯化

将上一步纯化收集得到的最大组分溶于Tris-HCl中，配成浓度为5mg/mL溶液，0.22μm滤膜过滤

后上样。流动相使用Tris-HCl洗脱液，流速为0.5mL/min，每10min收集一次洗脱液至试管中。

5.2.2.3洗脱曲线绘制

用硫酸-苯酚法测定洗脱液中多糖含量，在490nm处检测吸光值，绘制洗脱曲线。

5.3EPS鉴定

5.3.1紫外光谱扫描

检测纯化后的多糖是否含有核酸和蛋白质这两类杂质。用去离子水将以上获得的纯EPS溶解，浓度

为0.5mg/mL，用0.22μm滤膜过滤后在185nm～540nm波长范围内进行紫外扫描。样品流速为0.5

mL/min。流动相为去离子水。

5.3.2红外光谱分析

检测多糖化合物特有的结构基团。取干燥的1mg～2mgEPS和100mg～200mg溴化钾粉末混匀后进

行压片，厚度约0.1mm。红外光谱仪对样品进行红外扫描，按照GB/T32198执行。

5.4EPS分子量测定

5.4.1色谱条件

色谱柱：TSKGelG4000PWxl；

流动相：0.1MNaCl溶液；

流速：0.5mL/min；

进样量：200μL。

5.4.2分子量的测定

称取EPS样品适量，溶于0.1MNaCl溶液中，配成浓度为1mg/mL溶液，按5.4.1所述条件上样。使

用Astra数据分析软件计算样品的分子量。

5.5EPS单糖组成测定

5.5.1色谱条件

色谱柱：分析柱：CarboPacTMPA203×150mmAnalytical；

淋洗液：250mMNaOH和1MNaAC；

流速：0.5mL/min；

4

DB15/T2033—2020

进样体积：10μL；

柱温：35℃；

检测器：脉冲安培检测器，金电极。

5.5.2梯度洗脱条件

A为水，B为250mMNaOH，C为1MNaAC；

0min～20min：94%A，6%B，0%C；

20min～20.1min：89%A，6%B，5%C；

20.1min～35min：74%A，6%B，20%C；

35.1min～45min：20%A，80%B；

45.1min～55min：94%A，6%B。

5.5.3单糖组成测定

称取EPS