DB15∕T 2835-2022 马驽巴贝斯虫检测 PCR法

ICS65.020.30

CCSB41

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T2835—2022

马驽巴贝斯虫检测PCR法

PCRmethodfordetectionofbabesiosiscaballi

2022-12-08发布2023-01-08实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T2835—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。

本文件起草单位：中华人民共和国二连海关、内蒙古自治区市场监督管理评审查验中心。

本文件主要起草人：陈少博、杨帆、王伊琴、常鸿、包勇敢、荆文魁、腾克、赵治国。

I

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马驽巴贝斯虫检测PCR法

1范围

本文件规定了马驽巴贝斯虫PCR法和实时荧光PCR检测方法。

本文件适用于马属动物马驽巴贝斯虫病的分子生物学诊断。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

马驽巴贝斯虫babesiosiscaballi

马驽巴贝斯虫是引起马驽巴贝斯虫病的病原体，是一种寄生于马、驴、骡、斑马等马属动物红细胞

内的血液原虫。

聚合酶链式反应polymerasechainreaction；PCR

用于扩增位于已知序列之间DNA（deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸）的方法。模板DNA经过

高温变性成单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条互不互补的寡核苷酸片段即引物分别于模板DNA两

条链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以4种dNTP（deoxyribonucleoside

triphosphate，脱氧核苷酸三磷酸）为底物，使退火引物得以延伸，如此反复变性、退火和DNA合成这

一循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增，经25～30个扩增循环，扩增倍数达到106。

实时荧光PCRreal-timePCR

在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。

Ct值cyclethreshold

1

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每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

bp:碱基对(basepair)

CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammoniumbromide)

DNA:脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)

FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)

PCR:聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

TAMRA:羧基四甲基罗丹明(carboxy-tetramethyl-rhodamine)

Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]

5试剂与材料

水：符合GB/T6682的要求。

DNA提取试剂盒。

CTAB。

Tris-HCl(pH8.0)。

NaCl。

EDTA。

蛋白酶K溶液(20mg/mL)。

三氯甲烷。

异丙醇。

75%乙醇。

Taq酶。

dNTP（2.5mmol/L）。

PCRbuffer。

DNA分子量标准（DNAMarker）（50bp～500bp）。

实时荧光PCR预混液。

阳性对照样品：采用已知含有马驽巴贝斯虫的DNA，或经测序确认的阳性质粒。见附录B。

阴性对照样品：采用已知不含有马驽巴贝斯虫的DNA。

空白对照：ddH2O。

引物及探针:见表1。

2

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表1马驽巴贝斯虫检测引物及探针

检测方法引物/探针序列（5’-3’）扩增片段

上游引物

5′-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3′

（F）

PCR法200bp

下游引物

5′-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3′

（R）

上游引物

5′-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3′

（F）

实时荧光PCR法200bp

下游引物

5′-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3′

（R）

探针（P）5′-（FAM）-TGAGGCTAAGTACCAACCGCTG-（TAMRA）-3′

6仪器与设备

PCR仪。

凝胶成像仪。

实时荧光PCR仪。

高速台式离心机（最高转速12000rpm）。

旋涡振荡器（最高转速3000rpm）。

核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

恒温水浴锅。

天平（感量0.01g）。

单孔道微量移液器：0.5L～10L、10L～100L、20L～200L、100L～1000L。

7样品采集

使用添加EDTA抗凝剂的采样管无菌采集血样。

8检测方法

PCR法

8.1.1样品的总DNA提取

参照附录A中提取样品DNA的方法提取DNA，也可采用等效商品化的血液DNA提取试剂盒进行。当DNA

浓度吸光度值A260/A280在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增。设置至少两个平行样品且需设立阴性、阳性

及空白提取对照。

8.1.2PCR扩增

反应体系为50L，体系组成见表2。

3

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表2PCR扩增反应体系组成

试剂名称贮备液浓度反应体系体积L

10×Buffer(含Mg2+)－5

Taq酶5U/L0.25

dNTP2.5mmol/L5

上游引物（F）10mol/L2

下游引物（R）10mol/L2

模板－2

ddH2O－补足至50

检测过程分别设阴性对照、阳性对照和空白提取对照。

8.1.3PCR反应条件

预变性：95℃，3min；变性：95℃，30s；延伸退火：58℃，1min，35个循环；72℃延伸

5min；4℃保存。

8.1.4PCR扩增产物电泳检测

用TBE电泳缓冲液配制成1.5%琼脂凝胶。将琼脂凝胶放入电泳槽中，加入1×TBE电泳缓冲液，使液

面刚刚没过凝胶。将5L～8LPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合点样。9V/cm恒压电泳，直

至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。利用凝胶成像系统观察电泳结果并记录。

8.1.5结果判定与表述

8.1.5.1质量控制

质控对照应满足以下条件，否则应重新实验：

a)阳性对照:出现200bp的特异性条带；

b)阴性对照：不出现200bp的特异性条带；

c)空白对照：不出现200bp的特异性条带。

8.1.5.2结果判定

8.1.5.2.1质控对照成立条件下，两个平行样品均出现200bp的特异性条带为阳性。

8.1.5.2.2质控对照成立条件下，两个平行样品均不出现200bp的特异性条带为阴性。

8.1.5.3结果表述

8.1.5.3.1PCR产物为阳性者，表述为“检出马驽巴贝斯虫”。

8.1.5.3.2PCR产物为阴性者，表述为“未检出马驽巴贝斯虫”。

实时荧光PCR检测

8.2.1样品的总DNA提取

同7.1.1操作。

8.2.2荧光定量PCR扩增

4

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反应体系体积为25L，见表3。

表3荧光定量PCR扩增反应体系组成

试剂名称贮备液浓度mol/L反应体系体积L

PCR反应预混合液—12.5

上游引物（F）101

下游引物（R）101

探针（P）101

模板—2

ddH2O—补足至总体积为25

检测过程分别设阴性对照、阳性对照和空白提取对照。

8.2.3反应条件

预变性：95℃，3min；变性：95℃，15s；延伸退火：58℃，1min，40个循环。在58℃时

收集荧光信号值。

8.2.4结果判定与表述

8.2.4.1质量控制

质控对照应满足以下条件，否则应重新实验：

a)空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值大于等于40.0；

b)阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值大于等于40.0；

c)阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值小于等于35.0。

8.2.4.2结果判定

8.2.4.2.1质控对照成立条件下，2个平行样检测结果Ct值大于等于40.0，可判定被检样品为阴性。

8.2.4.2.2质控对照成立条件下，2个平行样检测结果Ct值小于等于35.0，可判定被检样品为阳性。

8.2.4.2.3质控对照成立条件下，至少1个平行样检测结果Ct值35.0～40.0，并出现典型的扩增曲

线，此时应适当增加DNA模板量重做实时荧光PCR检测。再次检测结果仍然Ct值小于40.0，并出现典

型的扩增曲线，可判定被检样品为阳性；再次检测结果Ct值大于等于40.0，可判定被检样品为阴性。

8.2.4.3结果表述

8.2.4.3.1检测结果为阳性者，表述为“检出马驽巴贝斯虫”。

8.2.4.3.2检测结果为阴性者，表述为“未检出马驽巴贝斯虫”。

9防止交叉污染措施

检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的规定执行。

5

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A

A

附录A

（资料性）

溶液配制及提取方法

A.1CTAB-提取缓冲液

将5gCTAB，20.45gNaCl，3.03gTris，1.86gNa2-EDTA溶于200mL水中，用盐酸调pH8.0

后，定容至250mL，115℃高压15min。

A.2CTAB-沉淀液

称0.2gCTAB,0.234gNaCl，定容至100mL，115℃高压15min。

A.31.2mol/LNaCl溶液：

称取28gNaCl，定容至400mL，115℃高压15min。

A.4DNA提取方法：

A.4.1称取样品0.5g～1g加入1.5mL～3.5mLCTAB提取液中，再加入12L～20L蛋白酶K（根据

CTAB量调节），每个样品提取2管，同时用水做空白提取对照。混匀后65℃至少1h(过夜孵育最好)，如

样品膨胀，则可再多加CTAB,每次多1mL，最多10mL。

A.4.24000rpm/min～5000r/min离心10min。

A.4.3将上清（约1mL）加入无菌EP中（2mL管），加入700L氯仿，涡旋30s后，再12000rpm离心

10min。

A.4.4取上清600L～650L加入无菌EP管中，加入2倍体积的CTAB沉淀液，旋涡混匀，室温静置1

min。

A.4.512000rpm离心10min，去上清。沉淀溶解于350L的1.2mol/LNaCl溶液。（2管合并共用350

L溶液）。

A.4.6加