DB35∕T 1958-2021 鸭巴泰病毒 RT-PCR 检测方法

ICS11.220

CCSB41

35

福建省地方标准

DB35/T1958—2021

鸭巴泰病毒RT-PCR检测方法

DetectionmethodofRT-PCRforduckBataivirus

2021-02-09发布2021-05-09实施

福建省市场监督管理局发布

DB35/T1958—2021

目次

前言..............................................................................II

1范围.................................................................................1

2规范性引用文件.......................................................................1

3术语和定义...........................................................................1

4设备、材料和试剂.....................................................................1

5样品采集、前处理和保存...............................................................2

6RT-PCR操作步骤.......................................................................2

7结果判定.............................................................................3

附录A（规范性）试剂的配制及引物参考序列...........................................4

附录B（资料性）RT-PCR检测结果电泳图...............................................6

I

DB35/T1958—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由福建省农业科学院提出

本文件由福建省农业农村厅归口。

本文件起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福州海关技术中心、福建省动物疫病预防控

制中心、宁德海关检验检疫技术中心。

本文件主要起草人：傅秋玲、傅光华、郑腾、李中华、叶洪、黄瑜、万春和、程龙飞、施少华、张

体银、刘荣昌、陈翠腾、彭春香、陈红梅、陈珍、朱春华。

II

DB35/T1958—2021

鸭巴泰病毒RT-PCR检测方法

1范围

本文件规定了鸭巴泰病毒核酸诊断的反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）的检测方法。

本文件适用于鸭巴泰病毒感染的流行病学监测和诊断。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文

件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用

于本文件。

GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法。

GB19489—2008实验室生物安全通用要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

鸭巴泰病毒Bataivirus；BATV

该病毒属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）正布尼亚病毒属（Orthobunyavirus）的成员，为有囊

膜病毒，其基因组为单股负链分节段RNA，大小约12kb，包含S、M和L等3个基因片段，分别编码病毒的

核衣壳蛋白，囊膜蛋白和聚合酶蛋白。

3.2

鸭巴泰病毒病Bataivirusdisease

鸭巴泰病毒病在我国养禽业中，尤其是种番鸭、麻鸭中流行，其临床表现以种（蛋）鸭产蛋下降、

卵巢出血和脾脏轻度出血为特征，与禽坦布苏病毒病相似，易引起临床混淆甚至误诊。此外，该病还危

害肉鸭，临床上以生长不良为特征。

4设备、材料和试剂

4.1设备

4.1.1PCR扩增仪。

4.1.2微量可调移液器（100µL～1000µL、20µL～200µL、2µL～20µL、0.5µL～10µL）。

4.1.3冰箱（2℃～8℃、-20℃）。

4.1.4高速冷冻离心机（其最高转速应大于12000r/min）。

4.1.5组织匀浆器。

4.1.6手术剪。

4.1.7手术镊。

1

DB35/T1958—2021

4.1.8电泳仪。

4.1.9电泳槽。

4.1.10凝胶成像系统。

4.1.11旋涡振荡器。

4.1.12超净工作台。

4.2材料和试剂

4.2.1试验用水应符合GB/T6682—2008中一级水的规格要求。

4.2.2磷酸盐缓冲液（PBS）配制方法见附录A的A.1。

4.2.3焦炭酸二乙酯处理水（DiethyPyrocarbonate，DEPC水）配制方法见附录A的A.2。

4.2.4Trizol。

4.2.5三氯甲烷。

4.2.6异丙醇。

4.2.7无水乙醇。

4.2.875%乙醇：配制方法见附录A的A.3。

4.2.9溴化乙锭溶液：配制方法见附录A的A.4。

4.2.101×TAE缓冲液：配制方法见附录A的A.5。

4.2.111.0%琼脂糖凝胶：配制方法见附录A的A.6。

4.2.12DNA相对分子质量标准物：DL2000。

4.2.1310×加样缓冲液：配制方法见附录A的A.7。

4.2.14RT-PCR检测用引物和使用方法见附录A的A.8。

4.2.15对照样品：以提取的鸭巴泰病毒提取的核糖核酸（Ribonucleicacid，RNA）作为阳性对照，

以其他禽源RNA病毒（如禽坦布苏病毒）RNA样品作为阴性对照，以灭菌去离子水作为空白对照。

5样品采集、前处理和保存

5.1样品采集和运输

采样所用器具（手术剪、手术镊和容器等）应预先灭菌处理，在采样过程中应戴一次性手套和口罩，

以免样品间交叉污染。采集产蛋下降疑似病鸭的卵巢或（和）脾脏装入灭菌过的容器中，编号后置于冷

藏箱内在24h内送至实验室。

5.2样品处理

在超净工作台中取出采集的待检样品置于灭菌平皿内，充分剪碎后与磷酸盐缓冲液按体积比1:3的

比例制成组织匀浆液，反复冻融3次后于4℃～10℃条件下8000r/min离心30min，取上清用于核酸

（RNA）的抽提，或置-20℃条件下冻存备用。

5.3样品保存

采集或处理的样品，在2℃～8℃条件下保存应不超过24h。否则，需保存在-20℃条件下，但时

间不超过7d；若需较长时间待处理，应保存在-70℃条件下，且应避免反复冻融。

6RT-PCR操作步骤

2

DB35/T1958—2021

6.1病毒RNA提取

病毒RNA提取应采用以下步骤或等效的商品化RNA提取试剂盒进行，且在实验操作过程中应遵守GB

19489—2008的要求。

取200μL待检样品，加入1mLTrizol试剂，用移液器充分混匀，室温放置5min；加入200μL

三氯甲烷，旋涡振荡30s混匀，室温放置15min；4℃下12000r/min离心15min；取上层水相加入等

体积异丙醇，上下颠倒数次混匀，-20℃放置20min；4℃下12000r/min离心15min；弃上清液，沉

淀用1mL75％乙醇清洗；10000r/min离心10min，弃上清液，沉淀室温干燥5min；加20μLDEPC

水溶解RNA沉淀。-20℃冰箱保存备用，RNA溶液应避免反复冻融，并尽快用于检测。空白对照、阴性对

照和阳性对照进行同步操作。

6.2RT-PCR反应

RT-PCR反应体系为25μL，每个反应管的反应体系为：依次加入14μL焦炭酸二乙酯（DEPC）处

理水，2.5μL反转录酶缓冲液，2.5μLTaq聚合酶缓冲液，0.5μLdNTP，0.5μLTaq聚合酶，0.5

μL反转录酶，0.5μLRNA酶抑制剂，上下游引物各0.5μL(10μmol/L)，样品的RNA各3μL。混

匀后2000r/min离心15s，使反应混合液都沉降到PCR管底。将上述混合物按照以下步骤进行RT-PCR：

第一步是反转录，42℃，30min；第二步是PCR循环，94℃预变性3min；循环参数为94℃变性30s，

52.4℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；最后，72℃延伸7min。反应结束后，可将产物保存

于4℃。

6.3RT-PCR产物电泳

反应结束后，分别取待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品和空白对照样品各5μLRT-PCR产物

与0.5μL加样缓冲液混合均匀，加入到1.0%琼脂糖凝胶板的样孔中；同时，在另一样孔中加5μLDL2

000标准分子量对照；以5V/cm的电压电泳30min后，经凝胶成像系统观察结果。

7结果判定

7.1结果判定标准

当阳性对照出现480bp特异性条带（见附录B电泳图2号泳道）、阴性对照（见附录B电泳图3号泳道）

和空白对照均无扩增条带（见附录B电泳图4号泳道）时，表明本次实验成立。

7.2结果判定

当待检样品出现480bp特异性条带（见附录B电泳图5号泳道），结果判为阳性，若无特异性扩增条

带（见附录B电泳图6号泳道），结果判为阴性。

3

DB35/T1958—2021

附录A

（规范性）

试剂的配制及引物参考序列

A.10.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）

NaCl8.0g

KCl0.2g

Na2HPO41.15g

KH2PO40.2g

将上述试剂溶于800mL灭菌双蒸水中，定容至1000mL，1.034×105Pa高压灭菌30min，4℃保

存备用。

A.2焦炭酸二乙酯（DEPC）处理水

于三蒸水按0.1%加入DEPC，磁力搅拌过夜，1.034×105Pa高压灭菌20min，冷却备用。

A.375%乙醇

取无水乙醇750mL加入灭菌双蒸水250mL，定容至1000mL，-20℃保存备用。

A.4溴化乙锭（EB）溶液

溴化乙锭20mg

灭菌双蒸水至20mL

说明：也可采用市售商品化的更环保、更安全的荧光染料，比如Goldviewer等。

A.51×TAE电泳缓冲液

A.5.1配制0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）

二水乙二铵四乙酸二钠18.61g

氢氧化钠（10%）调pH至8.0

灭菌双蒸水至100mL

A.5.2配制50×TAE电泳缓冲液

三羟基甲基氨基甲烷（Tris）242g

冰乙酸57.1mL

0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）100mL

灭菌双蒸水至1000mL

用时用灭菌双蒸水稀释50倍使用。

A.5.3配制1×TAE电泳缓冲液

50×TAE电泳缓冲液20mL

灭菌双蒸水至1000mL

A.61.0%琼脂糖凝胶

琼脂糖1.0g

4

DB35/T1958—2021

1×TAE电泳缓冲液至100mL

置微波炉中加热至完全融化，待冷至50℃～60℃时，加荧光染料溶液5µL，摇匀后倒入制胶板中，

待完全凝固后取下加样梳，备用。

A.710×加样缓冲液

聚蔗糖25g

溴酚蓝0.1g

二甲苯青0.1g

灭菌双蒸水至100mL

A.8RT-PCR检测用引物序列为

BATV-F5’-CTGCAGTTTTMAGATTGTTTC-3’

BATV-R5’-TGTTTTATTTCCTGTAGGTAC-3’

注1：M（A/C）。

注2：此对引物针对BATV囊膜蛋白M基因设计而成，扩增片段约480bp，用无菌双