温室棉花单株苗期抗旱评价技术规范

1温室棉花单株苗期抗旱评价技术规范本文件提供了温室棉花单株苗期（两叶一心期）抗旱评价的术语和定义、基本要求、胁迫浓度预实验、单株抗旱胁迫指标测定、综合抗旱评价流程及抗旱等级划分的指导。本文件适用于我国棉花主产区温室环境下，棉花品种苗期（两叶一心期）抗旱性鉴定与评价，亦适用于棉花抗旱育种中单株材料的早期筛选。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本使用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4407.1GB/T8321经济作物种子第1部分：纤维类农药合理使用准则（所有部分）GB/T19165-2019日光温室和塑料大棚结构与性能要求GB/T34812作物节水灌溉气象等级棉花GB/T51057-2015农业温室结构设计规范NY/T2544-2014作物抗旱性鉴定评价技术规范NY/T1143NY/T1276NY/T1925播种机质量评价技术规范农药安全使用规范总则在用喷杆喷雾机质量评价技术规范JJF1070定量包装商品净含量计量检验规则（电子天平、烘箱等仪器校准参考）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1两叶一心期Two-leafandone-heartstage棉花种子萌发出土后，第2片真叶完全展开、第3片真叶露心的生长阶段，依品种及温室环境而异，持续约10～15天。23.2生物学重复Biologicalreplication在相同温室环境、相同处理条件下，独立设置的3～4个单株样本单元，用于减少单株生长差异、操作误差，结果以“均值±标准差”表示。3.315%PEG6000模拟干旱15%PEG6000simulateddrought采用质量浓度15%的PEG6000（聚乙二醇6000）溶液调节土壤渗透压，诱导棉花单株产生干旱响应的胁迫方式。3.4存活率Survivalrate胁迫处理后，存活单株数占总单株数的百分比。3.5D值D-value基于主成分分析权重与隶属函数值计算的综合抗旱指数。3.6单株指标相对值Relativevalueofindividualplantindex干旱胁迫组单株指标测定均值与正常供水对照组单株指标均值的比值，用于消除品种固有生长差异。3.7叶片相对含水量Relativewatercontentofleaf反映叶片水分状况的生理指标，指叶片实际含水量与饱和含水量的百分比，用于辅助判断单株干旱胁迫程度。3.8Z-score标准化Z-scorestandardization消除指标量纲差异的数据处理方法，用于主成分分析前的数据分析预处理。3.9主成分分析Principalcomponentanalysis是将一组相互关联的指标进行信息浓缩,简化为少数几个主成分的多元统计分析方法。3.10隶属函数值Membershipfunctionvalue模糊集合中会用到的函数，是一般集合中指示函数的一般化，用于量化指标对干旱抗性的贡献程度。3.11Grubbs检验法Grubbstest一种异常值判定方法，通过计算可疑值与数据均值的偏离程度与标准差的比值，结合预设的显著性水平，判断该值是否为异常值，用于数据预处理中的异常值剔除。4符号和缩略语下列符号和缩略语适用于本文件，符号及缩略语清单见附录A。5基本要求5.1温室环境a）建设标准：温室建设应符合GB/T51057-2015和GB/T19165-2019的要求，确保结构稳固、通风系统完好、透光率需达到85%以上，覆盖材料无破损，满足温湿度与光照的精准调控；b）温度要求：25±2℃,昼夜温差≤5℃,低温不低于18℃,高温不高于32℃;c）相对湿度：60%～70%，通过通风、除湿设备控制，避免湿度过高引发病害；d）光照：光照强度300～400μ㏖・m-2・s-1，每日光照时长12h，阴天可通过LED植物生长灯补充光照，确保每日光照总量≥3.6㏖・m-2；e）环境监控：采用温湿度记录仪、光照传感器实时监测，每日记录数据，波动幅度≤±5%，避免非干旱因素（如光照骤变、低温胁迫）干扰实验结果。5.2种子质量要求棉花种子质量应符合GB4407.1的要求，选用饱满、无病虫害的种子，千粒重差异≤2%，发芽率≥85%，播种前可采用55℃温水浸种15min消毒，避免种子带菌影响育苗。5.3仪器设备a）播种工具：符合NY/T1143的精量播种器，保证穴播精度≥90%，用于育苗期单粒播种；b）测定仪器：电子天平（精度0.001g，符合JJF1070的规定，每年校准1次）、烘箱（控温精度±1℃,烘干室容积≥50L）、直尺（精度0.1cm，不锈钢材质防变形）、盆具（盆径20cm、高25cm，底部带3个排水孔，孔径0.5cm防土壤流失）；c）胁迫工具：容量瓶（1000mL，A级玻璃材质）、移液管（精度0.1mL，带刻度校准线）、喷壶（符合NY/T1925的小型喷杆喷雾器，雾化均匀度≥80%）；d）监控设备：温湿度记录仪（测量范围0℃~50℃、0%～100%RH，精度±0.5℃、±3%RH）、5.4基质与试剂5.4.1基质采用121℃高压蒸汽持续30min对壤土进行灭菌，用于杀灭病原菌与杂草种子，确保土壤的pH值在6.5～7.5、有机质含量≥1.5%、速效氮≥80mg/kg、速效磷≥30mg/kg、速效钾≥100mg/kg，每盆装土量1.8kg±5%，确保每盆基质重量一致；5.4.2试剂及要求a）PEG6000：分析纯，分子量5800～6200；b）蒸馏水：电导率≤10μS/cm；4c）除草剂：需符合GB/T8321的要求，选用棉田安全型除草剂，如精喹禾灵，育苗期杂草株高5cm时喷施。5.4.3PEG6000溶液配制准备工作——电子天平需提前30min预热校准；——1000mL容量瓶一只，用蒸馏水润洗3次；——烧杯；——玻璃棒；——25℃恒温水浴锅；——配制PEG6000所需的蒸馏水及PEG6000固形物。称量在烧杯中加入500mL蒸馏水，称取150gPEG6000；溶解将烧杯放入25℃恒温水浴锅，用玻璃棒搅拌30min，搅拌速度50r/min，避免产生大量气泡，至PEG6000完全溶解为溶液透明无颗粒状态。定容将溶液冷却至室温，转移至1000mL容量瓶，用少量蒸馏水润洗烧杯3次，洗液一并转入容量瓶，最后加蒸馏水至刻度线，摇匀。保存配制完成后立即使用，未用完的溶液需4℃冷藏保存在密封容器内以避免污染，保存时间不得超过6PEG6000胁迫浓度预实验6.1预实验设计6.1.1供试材料随机选取5个具抗旱梯度的棉花品种，并将其设置为编号V1-强抗旱、V2-中抗旱、V3-中抗旱、V4-较敏感、V5-干旱敏感，每个品种种子经浸种消毒后催芽至露白（芽长0.5cm）后播种。6.1.2处理设置PEG6000浓度梯度5——0%（CK，正常供水，土壤相对含水量70%～80%）；——10%；）；——20%。生物学重复设置每个品种每个浓度设3次重复，按照1重复=1盆1株的方式，共设置5×4×3=60盆，盆具按完全随机区组设计摆放，要求3个重复为1个区组，区组间间距50cm，避免相互干扰。育苗管理播种后覆盖1cm厚灭菌细土，温室温度保持28±2℃至出苗，出苗后降至25±2℃,每日浇水保持基质湿润。苗根系完整性保护操作1)脱盆：用手轻捏盆壁四周，使基质与盆壁分离，然后将盆倒置，轻拍盆底，使带土根系完整脱出（避免用力拉扯导致主根断裂）；2）洗根：将根系放入盛有蒸馏水的烧杯中，用软毛刷（刷毛硬度≤0.1mm）轻轻刷去附着的基质颗粒（避免刷伤须根），必要时可更换蒸馏水2～3次；3）检查：洗根后将根系放在滤纸上，观察是否有主根断裂（主根断裂长度＞1cm则样本作废）、须根脱落（须根保留率＜80%则样本作废）；4）吸干：用吸水纸（无绒毛，避免粘在根系上）轻轻包裹根系，吸干表面水分（时间≤30s，避免水分流失过多影响RFW测定）。6.2胁迫处理6.2.1胁迫时机棉花生长至两叶一心期，选择晴朗上午9:00前开始处理。6.2.2浇灌方式采用“一次性浇透法”，每盆缓慢浇灌对应浓度PEG溶液200mL±2mL，并确保溶液均匀渗入基质，无外流。之后每日上午补充50mL±1mL对应浓度PEG溶液，维持基质湿度稳定，持续胁迫7天。6.3指标测定6.3.1存活率测定观测频率胁迫开始时，记录所有单株均为存活，作为基准。胁迫后第3天、第7天分别观测，以胁迫第76天的存活状态作为最终判定依据。存活标准单株生长点无褐变，手触硬实有弹性，且至少1片子叶或真叶保持≥50%绿色面积，无完全焦枯、脱落。数据计算存活率（%）=某处理存活单株数/该处理总单株数×100，结果表示为“3次重复均值±标准差”。6.3.2同步验证指标叶片相对含水量RWC每重复选取存活单株的倒数第二片真叶，避开主脉剪取1cm×1cm叶块，立即称鲜重（FW）并记录数据，随后在25℃避光环境中使用蒸馏水浸泡4h后称饱和鲜重（SW）并记录数据，最后在80℃环境下烘干至恒重称干重（DW），将记录的三组数据按公式计算RWC。单株地上部干重SDW存活单株地上部份，从子叶节处剪断，用105℃杀青30min，用于终止生理活动，随后以80℃烘干6h至恒重，电子天平称量，取3次重复均值。6.4浓度验证结论当15%PEG6000处理满足以下3个条件时，确定为后续正式实验的胁迫浓度：——中度胁迫效应：抗旱品种V2、V3（抗旱品种等级划分见第九章表3）存活率60%～80%，且存活株叶片下垂角度≤45°;——差异显著性：品种间存活率、RWC、SDW的差异均达极显著水平（显著性概率值＜0.01，独立样本t检验）；——环境一致性：存活株RWC65%～75%，与大田中度干旱（土壤相对含水量50%～60%）下棉花苗期RWC范围一致。77单株抗旱指标测定（15%PEG6000胁迫）7.1样本准备处理设置：每品种设15%PEG胁迫组与0%PEG对照组，按照1重复=1盆1株的方式各3次重复，每个品种共6盆；生长调控：播种至两叶一心期的管理同，确保各重复单株株高差异≤10%，无病虫害；胁迫周期：两叶一心期开始胁迫，持续7天后单株生长指标差异已显现，且无大量死亡，并开始采样。7.2十项单株指标测定基于单株抗旱指标测定的实验设计，十项单株指标测定数量遵循以下标准：a）每品种设2组处理：15%PEG6000胁迫组和0%PEG6000对照组（CK）；b）每组设3次生物学重复，1重复=1盆1株（即每组独立测定3株单株，避免样本干扰）；c）数据精度要求及数据保留要求见附录B。最终每个指标的测定总量：每个品种胁迫组3株、对照组3株，所有指标均针对“单株”独立测定，数据不合并计算，仅后续计算相对值时用组内3株均值。7.3数据记录温室棉花单株苗期抗旱指标测定，记录每重复的原始数据，不得涂改（有误需划改并签字原始记录保存期不得少于3年，温室棉花单株苗期抗旱指标测定记录表格式见附录C。8综合抗旱评价流程8.1数据预处理8.1.1指标相对值计算通过胁迫组3次重复均值与对照组3次重复均值的比值，得出指标相对值，若相对值＞1.2或＜0.8，需核查：a）仪器是否校准；b）操作步骤是否有误；c）样本是否异常。确认无误后保留数据。8.1.2异常值剔除采用Grubbs检验法(α=0.05），计算Grubbs统计量，公式如下：8G值查Grubbs临界值表（如样本数n=10时，G=2.176若G值＞2.176则判定为异常值，予以剔除；若某指标异常值占比＞30%，需重新开展该品种的实验，以避免数据量不足影响评价，异常值判定见附录。。8.1.3数据标准化采用Z-score标准化处理指标相对值，消除量纲差异，计算公式为：8.2相关性与主成分分析本规范中相关性分析与主成分分析（PCA）所用软件为SPSS26.0或R4.2.0（搭配corrplot包两种软件均可满足数据分析需求，结果具有一致性，可根据实验团队操作习惯选择使用。8.2.1相关性分析输入数值：输入所有供试品种的10项单株指标相对值（即各品种胁迫组3次重复均值与对照组3次重复均值的比值，包含SFW相对值、RFW相对值、TFW相对值、PH相对值、HM相对值、SDW相对值、RDW相对值、TDW相对值、RSR相对值、PWC相对值），形成“品种-指标相对值”数据矩阵。得到结果：输出包含10项指标间两两关联的Pearson相关系数矩阵，以及每个相关系数对应的显著性P值。对照结果得到答案：1）通过P值判断指标与抗旱性的关联程度——保留P＜0.05的指标（此类指标与抗旱性显著相关，可用于后续抗旱评价）；92）通过相关系数绝对值判断指标冗余性——若两项指标间相关系数|r|＞0.8（表明指标信息高度重叠），结合生物学意义剔除1项（如PH相对值与HM相对值高度相关时，因PH更全面反映单株整体生长状况，故保留PH相对值、剔除HM相对值最终筛选出无冗余且与抗旱性显著相关的核心指标。8.2.2主成分分析（PCA）输入数值：输入经相关性分析筛选后的“核心指标Z-score标准化值”（即对保留的无冗余、与抗旱性显著相关的指标，按规范中Z-score标准化公式处理后的数据，标准化后数据均值为0、标准差为1），形成“品种-核心指标标准化值”数据矩阵。得到结果：输出适用性检验结果（KMO检验值、Bartlett球形检验P值）、主成分载荷矩阵（各核心指标在不同主成分上的载荷系数）、各主成分的特征值与方差贡献率（含单个主成分方差贡献率、累计方差贡献率）、各品种的主成分得分（每个品种在提取出的各主成分上的具体得分）。对照结果得到答案：1）判断数据是否适合PCA——若KMO＞0.5且Bartlett球形检验P＜0.001，说明核心指标间存在显著相关性，数据适合进行主成分分析；2）确定主成分提取数量——提取“特征值＞1.0”的主成分，且需保证这些主成分的“总累计方差贡献率≥85%”（确保保留核心指标的大部分信息若累计贡献率不足85%，需增加主成分提取数量直至满足要求；3）公因子归类——将“主成分载荷矩阵中绝对值＞0.5”的核心指标归为同一公因子（如SDW标准化值、RDW标准化值、TDW标准化值在某主成分上载荷均＞0.5，可将该主成分归为“生物量因子”4）计算主成分权重——以各主成分的“单个方差贡献率”占“总累计方差贡献率”的比例作为该主成分的权重（Wi），权重之和为1，用于后续综合D值的计算。8.3D值计算（隶属函数法）8.3.1隶属函数值计算因本规范中10项指标均为“正向指标”（指标值越大，单株抗旱性越强采用升型隶属函数。式中：）；8.3.2综合D值计算按主成分权重加权求和。D值=Σwi×μ(PCi)式中：D值——结果表示为“D±SD”（SD为3次重复D值的标准差，反映数据稳定性，SD＜0.05为稳定Σ——对一系列数值进行求和；wi——主成分的权重；8.4结果验证输入数值：输入所有供试棉花品种的综合抗旱指数D值，形成“品种-D值”数据矩阵（如品种V1的D值为0.62±0.02、品种V2的D值为0.55±0.03等）。得到结果：1）输出聚类结果树状图与聚类分组表；2）树状图直观展示各品种间的聚类关系，可清晰识别不同品种因D值差异形成的聚类分支；3）聚类分组表明确标注每个品种最终所属的聚类组（如组1包含D值≥0.59的品种、组2包含0.51≤D＜0.59的品种等）。对照结果得到答案：1）对照聚类分组表与D值：a）若同一聚类组内所有品种的D值数值相近（如组内品种D值均在0.51～0.59区间）b）不同聚类组间品种的D值差异显著（如组1与组2的D值区间无重叠），说明聚类结果能反映D值的内在关联；2）对照聚类分组与“8抗旱等级划分”：a）若每个聚类组对应的品种D值范围、存活率及形态特征，均与规范“8抗旱等级划分”中的某一抗旱等级（强抗旱型Ⅰ、中抗旱型Ⅱ等）完全匹配（如某聚类组品种均符合“中抗旱型”的D值范围0.51≤D＜0.59、存活率70～90%），则判定D值评价结果可靠；b）若聚类分组与抗旱等级存在错位（如某聚类组同时包含强抗旱型与敏感型品种需核查D值计算过程（如指标标准化、主成分权重等）是否存在误差，重新验证数据。9抗旱等级划分结合15%PEG6000胁迫下的D值、存活率及单株形态特征，将棉花单株苗期抗旱性分为5个等级，等级间D值间隔≥0.08，避免交叉重叠。温室棉花单株苗期抗旱等级划分见表1。表1温室棉花单株苗期抗旱等级划分表ⅠⅡⅢⅣⅤ<0.31±0.05<50部分单株死亡，存活株叶片大量焦附录A（资料性）符号及缩略语清单A.1符号清单下列符号适用于本文件。符号符号符号名称符号名称符号注释符号注释Xμσ反映同一指标多次重复数据的离散程度，用于标准PCiΣ用于综合抗旱指数（D值）的加权求和计算，即对A.2缩略语清单下列缩略语适用于本文件。PEG-温室环境核心调控指标，反映空气中水汽含量------地上部收获后经吸干表面水分的重量，直接反根系经冲洗、吸干表面水分后的重量，直接-单株地上部干重与根干重之和，反映单株整体生物量（TD-反映单株整体水分状况，按公式PWC（%）=(TFW-TDW)/TF-主成分分析适用性检验指标，KMO＞0.5表明数--附录B（规范性）十项单株指标测定结果保留3位小数-），），----（资料性）温室棉花单株苗期抗旱指标测定记录表附录D（规范性）温室棉花单株苗期抗旱评价数据异常值判定、处理及Grubbs临界值表D.1附录目的本附录为资料性附录，紧密配合正文“8.1数据预处理”中“8.1.2异常值剔除”条款使用，明确单株抗旱指标（如地上部鲜重SFW、根干重RDW、叶片相对含水量RWC等）测定数据的异常值类型、判定标准、处理流程，同时提供Grubbs检验法(α=0.05，双尾检验）的临界值数据，确保用于D值计算的数据具备可靠性与有效性，符合本规范“精准评价棉花单株苗期抗旱性”的核心目标。D.2异常值类型定义结合本规范第5章和第7章的实验设计与操作要求，数据异常值分为以下3类，均与实验关键环节直接关联：仪器误差类：因测定仪器（电子天平、烘箱、直尺等，需符合正文5.3仪器设备要求）未校准或性能异常，导致指标数据偏离真实值；操作误差类：因样本处理（根系脱盆冲洗、叶片取样、烘