DB34∕T 3660-2020 鸭肝炎病毒1型和3型双重RT-PCR检测方法

ICS11.220

B41

DB34

安徽省地方标准

DB34/T3660—2020

鸭肝炎病毒1型和3型双重RT-PCR

检测方法

DuplexRT-PCRassayfordetectionofduckhepatitisvirustype1andtype3

文稿版次选择

2020-08-03发布2020-09-03实施

安徽省市场监督管理局发布

DB34/T3660—2020

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所提出。

本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所、安徽省动物疫病预防与控制中心、太湖县小

池镇农业农村综合服务中心、合肥野生动物园、铜陵市动物疫病预防与控制中心、铜陵市义安区畜牧兽

医局。

本标准主要起草人：潘孝成、占松鹤、沈学怀、何学丰、郭长进、范萍萍、尹磊、赵瑞宏、戴银、

何为俊、吴娟、胡晓苗、侯宏艳、周学利、张丹俊、周迎春、王军。

I

DB34/T3660—2020

鸭肝炎病毒1型和3型双重RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了鸭肝炎病毒1型（DHV-1）和鸭肝炎病毒3型（DHV-3）双重RT-PCR检测方法的技术要求。

本标准适用于鸭病变肝组织、接种疑似病料的鸭胚尿囊液或细胞培养物中DHV-1型和DHV-3型核酸的

检测。

2缩略语

下列缩略语适用于本文件。

DHV：鸭肝炎病毒(duckhepatitisvirus）

RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reversetranscription-polymerasechainreaction）

RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）

DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）

Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）

dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）

M-MLV：莫洛尼氏鼠白血病病毒（moloneymurineleukemiavirus）

PBS：磷酸缓冲液（phosphatebuffersolution）

TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（trisacetate-EDTAbuffer）

EB：溴化乙锭（ethidiumbromide）

3主要仪器

3.1PCR扩增仪。

3.2台式低温高速离心机（最大离心力12000g以上）。

3.3电泳仪。

3.4凝胶成像系统。

3.5冰箱（-20℃；-80℃）。

3.6微波炉。

3.7分析天平（感量0.01g）。

3.8水浴锅。

3.9微量移液器（2.5µL；10µL；200µL；1000µL）。

4试剂

4.1RNA抽提试剂：Trizol或其他商品化RNA提取试剂。

4.2氯仿、异丙醇、无水乙醇，均为分析纯。

1

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4.3M-MLV反转录酶。

4.4RNA酶抑制剂。

4.5DEPC处理的灭菌水。

4.6TaqDNA聚合酶。

4.7dNTP。

4.8DNA分子标准（DNAMarker）。

4.9RT-PCR反应试剂。

4.10EB（10µg/µL）或核酸染料。

4.11磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/L，pH7.2），见附录A中的A.1。

4.1250×TAE电泳缓冲液，见附录A中的A.2。

4.131％琼脂糖凝胶，见附录A中的A.3。

4.14引物：DHV-1扩增上游引物，5’-GGTGATTCTAACCAGTTGGGG-3’，下游引物，

5’-TTCAATTTCCAGATTGAGTTCAAA-3’；DHV-3扩增上游引物，5’-GATGTAGTTATGGTGCTTAGACGC-3’，下游

引物，5’-ACGAACCAGCCATTGACG-3’，引物浓度均为10pmol/µL。

4.15阳性对照样品：DHV-1和DHV-3鸭胚接种尿囊液毒；阴性对照样品：正常鸭胚尿囊液。

5样品的采集及处理

5.1采样工具

15mL离心管、1.5mL离心管、剪刀、镊子和研钵，经121（±2）℃，15min高压灭菌并烘干。

5.2采样与处理

5.2.1鸭病变肝组织

采取病死或剖杀鸭的肝组织1g左右，按1:5倍体积加入0.01mol/LpH7.2PBS，研磨冻融3

次，装入15mL灭菌离心管中，8000g离心10min，取上清液转入1.5mL离心管中，-80℃保存备

用。

5.2.2鸭胚尿囊液和细胞培养物

鸭胚尿囊液、细胞培养物冻融3次，转入1.5mL离心管中，-80℃保存备用。

6RT-PCR检测

6.1RNA提取

6.1.1用Trizol或其他商品化RNA提取试剂提取待测样品、阳性对照和阴性对照样品的RNA。

6.1.2200μL的样品和800μLTrizol置于一个1.5mL离心管，反复颠倒混匀，室温静置5min。

6.1.312000g4℃离心5min，吸取上清液移入新的离心管中，加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，

室温静置5min。

6.1.412000g4℃离心15min，吸取上清液移入新的离心管中（注意不要吸出中间层），加入等体

积异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min。

6.1.512000g4℃离心10min，小心弃去上清液，加入75％乙醇1mL（DEPC水配制）。

6.1.612000g4℃离心5min，弃去乙醇，室温干燥2～5min，加入适量DEPC水，-80℃保存备用。

2

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6.2反转录（cDNA合成）

6.2.1在PCR反应管中依次加入：OligodTPrimerorRandomPrimers1μL，dNTPs(10mmol/L)1μL，

检测样品RNA3μL，DEPC水6μL。

6.2.2水浴锅或PCR仪中，65℃作用5min，冰上急冷2min。

6.2.3在上述反应管中再依次加入：

——5×RTBuffer4μL，RNaseInhibitor（40U/μL）0.5μL，M-MLV反转录酶（200U/μL）1μL，

DEPC水3.5μL。

6.2.4PCR仪中，42℃作用60min，再70℃作用15min，-20℃保存备用。

6.3PCR反应

6.3.1PCR反应体系

10×PCRBuffer2.5μL，DHV-1和DHV-3上游引物各1μL，DHV-1和DHV-3下游引物各1μL，

dNTPs(2.5mmol/L)2μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，反转录产物5μL，灭菌去离子水11.25μL，

总反应体系25μL。

6.3.2PCR反应条件

94℃5min；94℃1min，52℃50s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

6.4电泳检测

将PCR扩增产物5μL与2μL上样缓冲液混合，点样于1％琼脂糖凝胶板加样孔中，琼脂糖凝

胶板一侧点样孔加入DNAMarkerIII，缓冲液为1×TAE，以5V/cm电压电泳30min左右。电泳后，

置于凝胶成像系统下观察，根据DNA分子质量大小（DNAmarker）判断RT-PCR扩展产物大小。

7结果判定

7.1当阳性对照在预期大小的位置720bp和642bp出现特异性条带，阴性对照均未出现预期大小

目的条带时，实验结果成立。

7.2被检样品在720bp位置出现特异性条带为DHV-1核酸阳性，被检样品在642bp位置出现特异

性条带为DHV-3核酸阳性。如图1所示。

3

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图中：

M——DL2000Marker；

1——阳性对照样品；

2——DHV-1阳性样品；

3——DHV-3阳性样品；

4——阴性对照样品。

图1PCR扩增电泳图

4

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AA

附录A

（规范性附录）

试剂配制

A.10.01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）的配制

A.1.10.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）71.6g，先加适量灭菌去离子

水溶解，最后定容至1000mL，混匀。

A.1.20.2mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）27.6g，先加适量灭菌去离子水

溶解，最后定容至1000mL，混匀。

A.1.3量取0.2moL/L磷酸氢二钠溶液36mL，0.2mol/L磷酸二氢钠溶液14mL，称取氯化钠8.

5g，加灭菌去离子水800mL，调pH值至7.2，最后定容至1000mL，4℃保存。

A.2电泳缓冲液（50倍）

A.2.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）

二水乙二铵四乙酸二钠（分析纯）18.61g

灭菌双蒸水80mL

氢氧化钠（分析纯）