DB 51T 921-2009 水稻白叶枯病菌检验鉴定技术规程

DB51T9212009水稻白叶枯病菌检验鉴定技术规程1范围本标准规定了水稻白叶枯病菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzae）的检验鉴定技术方法，包括病原菌的分离培养、形态学鉴定、生理生化特性测定、分子生物学检测以及致病性测定等内容。本标准适用于水稻种子、秧苗、成株及田间病株中水稻白叶枯病菌的检验鉴定，也适用于水稻白叶枯病的流行监测和病害防控。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求NY/T1156.2农药室内生物测定试验准则杀菌剂第2部分：抑制病原真菌孢子萌发试验平皿法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1水稻白叶枯病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzae引起水稻白叶枯病的病原细菌，属黄单胞菌属（Xanthomonas），革兰氏阴性，好氧，杆状，单鞭毛。3.2致病性pathogenicity病原物侵染寄主植物并引起病害的能力。3.3分离培养isolationandcul4原理水稻白叶枯病菌主要通过水稻植株的伤口或水孔侵入，在维管束系统内繁殖并扩展，引起叶片出现白叶枯症状。本标准基于病原菌的形态特征、培养特性、生理生化反应、分子生物学特征以及致病性等方面的差异，建立了一套完整的检验鉴定技术体系。病原菌分离培养采用选择性培养基，通过形态特征和染色特性进行初步鉴定；生理生化测定通过病原菌对不同碳源的利用能力、酶活性等生化反应进行进一步确认；分子生物学检测基于病原菌特异性DNA序列，采用PCR技术进行快速准确鉴定；致病性测定通过人工接种试验验证病原菌的致病能力。5仪器设备与试剂材料5.1仪器设备5.1.1生物显微镜：具油镜装置，放大倍数400×~1000×。5.1.2超净工作台：垂直流型，洁净度达到100级。5.1.3恒温培养箱：温度控制范围20℃~40℃，精度±0.5℃。5.1.4高压灭菌锅：工作温度121℃，压力0.1MPa~0.15MPa。5.1.5PCR仪：梯度温度控制功能，温度精度±0.2℃。5.1.6电泳仪：电压0~300V可调，电流0~400mA可调。5.1.76检验鉴定方法6.1样品采集与处理6.1.1种子样品：随机抽取种子样品不少于1000粒，用无菌水冲洗3次，在无菌条件下研磨成匀浆，备用。6.1.2植株样品：采集具有典型白叶枯症状的叶片，用75%乙醇表面消毒30s，无菌水冲洗3次，剪取病健交界处组织约1g，在无菌条件下研磨成匀浆，备用。6.1.3田间病株：在发病田块采用五点取样法，每点采集5株具有典型症状的植株，按6.1.2方法处理。6.2病原菌分离培养6.2.2挑取黄色、圆形、边缘整齐、表面光滑的典型菌落，在NA培养基上进行纯化培养，获得纯培养物。6.3形态学鉴定6.3.1菌体形态：取24h培养物进行革兰氏染色，油镜观察。水稻白叶枯病菌为革兰氏阴性短杆菌，大小为0.5~0.8μm×1.0~2.0μm，单极生鞭毛。6.3.2菌落特征：在NA培养基上28℃培养48h，菌落呈圆形、黄色、表面光滑、边缘整齐、半透明、直径1~2mm。6.4生理生化特性测定6.4.1氧化酶试验：阳性，菌落在30s内变为深紫色。6.4.2过氧化氢酶试验：阳性，立即产生气泡。6.4.3硝酸盐还原试验：阳性，培养液变红。6.4.4明胶液化试验：阳性，明胶被液化。6.4.5淀粉水解试验：阳性，菌落周围出现透明圈。6.5分子生物学检测6.5.1DNA提取：采用CT