DB22-T 1619-2011 牛尿中盐酸克伦特罗残留量的测定 液相色谱-质谱-质谱法

DB22T16192011牛尿中盐酸克伦特罗残留量的测定液相色谱质谱质谱法1范围本标准规定了牛尿中盐酸克伦特罗残留量的液相色谱质谱质谱测定方法。本标准适用于牛尿中盐酸克伦特罗残留量的测定。本方法的检出限为0.1μg/kg，定量限为0.3μg/kg。2原理试样中的盐酸克伦特罗用β葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶水解，经乙酸乙酯提取，正己烷脱脂，MCX固相萃取柱净化，液相色谱质谱质谱法测定，外标法定量。3试剂和材料除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1甲醇：色谱纯。3.2乙腈：色谱纯。3.3乙酸乙酯。3.4正己烷。3.5甲酸：色谱纯。3.6氨水。3.7β葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶：含β葡萄糖醛酸酶≥100000U/mL，芳基硫酸酯酶≥1000U/mL。3.8盐酸克伦特罗标准品：纯度≥98.5%。3.9盐酸克伦特罗标准储备液：准确称取盐酸克伦特罗标准品10.0mg，用甲醇溶解并定容至100mL，配制成100μg/mL的标准储备液，18℃避光保存，有效期6个月。3.10盐酸克伦特罗标准工作液：吸取适量标准储备液，用甲醇逐级稀释成1.0μg/mL的标准工作液，4℃避光保存，有效期1个月。3.110.1%甲酸水溶液：取1.0mL甲酸，用水定容至1000mL。3.125%氨水甲醇溶液：取5.0mL氨水，用甲醇定容至100mL。3.13MCX固相萃取柱：60mg，3mL，或相当者。3.140.22μm有机滤膜。4仪器和设备4.1液相色谱质谱质谱联用仪：配电喷雾离子源（ESI）。4.2分析天平：感量0.0001g和0.01g。4.3离心机：转速≥4000r/min。4.4涡旋混合器。4.5氮吹仪。4.6恒温水浴锅。4.7固相萃取装置。4.8pH计：精度±0.02。4.9超声波清洗器。4.10离心管：50mL，具塞。4.11容量瓶：10mL、25mL、50mL、100mL。4.12移液器：10μL、100μL、1000μL、5000μL。5试样制备与保存5.1试样采集采集牛尿样品于洁净容器中，每份样品不少于50mL。5.2试样保存5.3试样处理5.3.1取解冻后的牛尿样品5.0mL于50mL离心管中，加入0.2mol/L乙酸铵缓冲溶液（pH5.2）2.0mL，涡旋混匀。5.3.2加入β葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶50μL，涡旋混匀，于37℃水浴中水解16h。5.3.3水解完成后，加入乙酸乙酯10mL，涡旋提取3min，以4000r/min离心5min。5.3.4将上层有机相转移至另一离心管中，重复提取一次，合并有机相。5.3.5向合并的有机相中加入正己烷5mL，涡旋混匀，以4000r/min离心5min，弃去上层正己烷层。5.3.6将下层乙酸乙酯相于40℃水浴中氮吹至近干，加入3mL0.1%甲酸水溶液溶解残渣，涡旋混匀，待净化。5.3.7将MCX固相萃取柱依次用3mL甲醇、3mL水活化，将待净化溶液上柱，控制流速不超过1mL/min。5.3.8依次用3mL水、3mL甲醇淋洗，抽干。用5mL5%氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液。5.3.9将洗脱液于40℃水浴中氮吹至干，用1.0mL甲醇水（10+90，v/v）溶解残渣，涡旋混匀，经0.22μm有机滤膜过滤，供液相色谱质谱质谱测定。6测定步骤6.1.1色谱柱：C18柱，150mm×2.1mm，3.5μm，或相当者。6.1.2流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈。6.1.3梯度洗脱程序：0min时A为90%，B为10%；5min时A为10%，B为90%；7min时A为10%，B为90%；7.1min时A为90%，B为10%；10min时A为90%，B为10%。6.1.4流速：0.3mL/min。6.1.5柱温：30℃。6.1.6进样量：10μL。6.2.1离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子模式。6.2.2检测方式：多反应监测（MRM）。6.2.3喷雾电压：5500V。6.2.4雾化气压力：50psi。6.2.5干燥气温度：550℃。6.2.6干燥气流速：10L/min。6.2.7盐酸克伦特罗的监测离子对：m/z277→203（定量离子），m/z277→259（定性离子）。6.3标准曲线的制备吸取适量盐酸克伦特罗标准工作液，用甲醇水（10+90，v/v）稀释成0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL的标准系列溶液，按6.1和6.2的条件进行测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。6.4样品测定取待测样品溶液，按6.1和6.2的条件进行测定，根据标准曲线计算样品中盐酸克伦特罗的含量。7结果计算试样中盐酸克伦特罗的含量按式（1）计算：X=(c×V)/m式中：X——试样中盐酸克伦特罗的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；c——从标准曲线上查得的样液中盐酸克伦特罗的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V——样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；m——试样质量，单位为克（g）。计算结果保留两位有效数字。8精密度和准确度8.1精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果