DB65-T 4680-2023 健康人群脑膜炎奈瑟菌带菌率调查技术规范

CCSC01DB65/T4680—2023健康人群脑膜炎奈瑟菌带菌率调查技术规范Technicalspecifica2023-07-20发布2023-09-20实施IDB65/T4680—2023前言 12规范性引用文件 1 4缩略语 15调查人群 26调查技术要求 2附录A(规范性)带菌率调查流程图 4附录B(规范性)带菌率调查登记表 5附录C(规范性)STGG肉汤管配制方法 6 7附录E(规范性)脑膜炎奈瑟菌培养 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心提出。本文件由新疆维吾尔自治区卫生健康委员会归口并组织实施。本文件起草单位：新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心、新疆医科大学第一附属医院、新疆喀什地区卫生健康委员会、新疆维吾尔自治区标准化研究院。本文件主要起草人：谢娜、岳锡宏、符文慧、陈兆云、陈涛、凯赛尔·吾斯曼、彭孝旺、李娟、孙璐、王崇伟、关丽娜。本文件实施应用中的疑问，请咨询新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心。对本文件的修改意见，请反馈至新疆维吾尔自治区卫生健康委员会(乌鲁木齐市天山区新疆龙泉街191号)、新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心(乌鲁木齐市天山区东泉路街道碱泉一街380号)、新疆维吾尔自治区市场监督管理局(乌鲁木齐市天山区新华南路167号)。新疆维吾尔自治区卫生健康委员会电话真编：830001新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心电话真编：830011新疆维吾尔自治区市场监督管理局电话真编：830004DB65/T4680—20231健康人群脑膜炎奈瑟菌带菌率调查技术规范本文件规定了脑膜炎奈瑟菌带菌率调查的术语和定义、缩略语、调查人群、调查技术要求。本文件适用于健康人群脑膜炎奈瑟菌带菌率调查。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1流行性脑脊髓膜炎meningococcalmeningitis由脑膜炎奈瑟菌通过呼吸道传播引起的化脓性脑膜炎，简称“流脑”。脑膜炎奈瑟菌Neisseriameningitidis引起流脑的病原体。带菌率carriagerate健康人群中，口咽部携带有脑膜炎奈瑟菌的比例。密切接触contact指同吃同住人员，包括家庭成员、托儿所、幼儿园、学校里的同班者及处在同一小环境中的人群。4缩略语下列缩略语适用于本文件。MM:流脑(MeningococcalMeningitis)Nm:脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)CFU/mL:每毫升菌落形成单位(ColonyFormingUnitpermL)Real-timePCR:实时荧光聚合酶链式反应(Real-timePolymeraseChainReaction)STGG:脱脂奶粉胰蛋白葡萄糖甘油肉汤(SkimmilkTryptoneGlucoseGlycerolbroth)sodC基因：铜-锌超氧化物歧化酶基因(superoxidedismutase[Cu-Zn])2DB65/T4680—2023ctrA基因：荚膜转运基因(capsuletransportA)5调查人群被调查的健康人群应同时符合以下两种情况：a)一周内无流脑相关症状，包括发热、头痛、呕吐、脑膜刺激征等。b)一周内无流脑病例密切接触史。6调查技术要求6.1流行病学调查6.1.1明确调查流程带菌率调查流程图见附录A。6.1.2带菌率调查登记表带菌率调查登记表见附录B。6.1.2.1基本资料的收集收集被调查人群的基本情况，包括以下内容：a)姓名；b)性别；e)职业；f)居住方式；g)呼吸系统疾病；h)抗生素使用情况；i)流脑疫苗接种史。6.1.2.2流脑疫苗接种信息的收集收集被调查人群的流脑疫苗接种情况，包括疫苗的种类、接种次数、接种日期等资料。6.2口咽拭子标本的采集、运输、处理及保存6.2.1标本的采集6.2.1.1采集前准备6.2.1.1.1试剂及耗材一次性无菌口咽拭子、压舌板、哥伦比亚血平板、双抗巧克力平板或双抗哥伦比亚血平板、STGG肉汤管等。STGG肉汤管的配制方法见附录C。DB65/T4680—202336.2.1.1.2调查采样人员确定采样人员应为经过培训的专业技术人员。6.2.1.1.3调查采样人员防护调查采样人员应穿工作服(白大褂)、戴一次性使用帽子、穿一次性使用隔离衣、戴一次性乳胶手套、戴一次性使用外科口罩。6.2.1.2采集6.2.1.2.1每个被采样者应采集1支口咽拭子，采样前准备一次性使用采样器(口咽拭子)。6.2.1.2.2采样时，被采样者应张大口，发出“啊”的声音，用压舌板下压舌中部，暴露出咽喉部位。6.2.1.2.3将一次性使用采样器(口咽拭子)伸进咽喉部位，在咽后壁悬雍垂后上方的位置迅速用力6.2.1.2.4采集完成后，将口咽拭子标本头部放入STGG肉汤管中，使拭子头部完全浸入液体中，多出的部分折断丢弃，拧紧螺旋管盖。6.2.2运输标本采集完成后，需在2℃~8℃冷藏状态下4h之内尽快送至实验室。6.2.3处理和保存6.2.3.1标本采集后，置于漩涡振荡器上连续振荡1min,直接进行Real-timePCR检测(见附录D)和脑膜炎奈瑟菌培养(见附录E)。6.2.3.2冷冻样品，从冰箱或干冰中取出STGG肉汤管，室温放置至完全融化。按以上步骤进行标本的处理。6.3菌株保存及运输6.3.1菌株可保存于脱纤维羊血管或10%的脱脂牛奶管，—20℃长期保存。6.3.2菌株需在冷冻或冻干状态下运输。4DB65/T4680—2023(规范性)带菌率调查流程图A.1带菌率调查流程带菌率调查流程图见图A.1。确定调查人群流行病学调查口咽拭子标本的采集集开展生化实验生化实验阳性阴性血清学分型实验血清群特异性荧光PCR检测血清学分型实验菌株保存图A.1带菌率调查流程图5DB65/T4680—2023带菌率调查登记表B.1健康人群带菌率调查登记带菌率调查登记表见表B.1。表B.1带菌率调查登记表姓名性别(1.男；2.女)民族职业居住方式(1聚居；2一周内有无呼有；2不详)与A+C群；苗名称);未种)备注注1:采样编号由9位数字组成，前6位是县国标编码，后3位是自然顺序示例：阿克苏地区库车市调查的第21个适龄儿童，采样编号是66(规范性)STGG肉汤管配制方法STGG肉汤管配制试剂见表C.1。表C.1STGG肉汤管配制试剂成分用量胰蛋白大豆肉汤基础粉葡萄糖粉2.5g脱脂奶粉甘油50mL双蒸水500mL注：按照比例调整每种成分的用量，以配制实际需求量。C.2配制方法C.2.1在大小合适的干净容器里依次放入双蒸水、胰蛋白大豆肉汤基础粉、脱脂奶粉和葡萄糖粉；C.2.2将容器置于磁力搅拌器上，室温高速(1000rpm~1500rpm)搅拌20min,直到完全溶解；C.2.3加入甘油，室温中速(500rpm~1000rpm)继续搅拌10min;C.2.4将溶液分装于1.5mL的冻存管中，每支分装1mL,拧上螺帽(留少量空隙);C.2.5将装有溶液的冻存管置于121℃,103kPa~137kPa,高压10min,取出，置室温冷却，拧紧螺帽。C.3质量检测C.3.1无菌实验随机挑取3支冻存管，用无菌枪头从每支中吸取100μL肉汤，接种于哥伦比亚血平板(倾斜法),待完全吸收后将平板置于37℃,5%CO2条件下培养24h,观察是否有菌落生长，无任何菌落生长的肉汤继续进行生长实验。C.3.2生长实验取少许新鲜培养的脑膜炎奈瑟菌菌苔，置于无菌生理盐水中配制0.5麦氏单位的菌悬液(菌落计数约为2×108CFU/mL),稀释1×105倍，取100μL接种于哥伦比亚血平板(用接种环涂抹至整个平板),待完全吸收后将平板置于37℃,5%CO2条件下培养24h,计数平板上的菌落；同时，取10μL1×10³倍稀释的菌悬液，放入一支无菌肉汤管中，并将肉汤管置于—20℃以下冻存1天，取出置室温融化，漩涡振荡使其完全混匀，取100μL接种于哥伦比亚血平板，同上进行菌落计数；两次计数结果差距在20%以内，则肉汤质量合格。C.4保存将合格的肉汤管置于4℃~6℃(最长可保存6个月)或冷冻条件下保存(最长1年)。7DB65/T4680—2023(规范性)Real-timePCR检测D.1种特异性Real-timePCR检测D.1.1用于Real-timePCR检测，脑膜炎奈瑟菌的目的基因为ctrA。ctrA阳性者可认为相应的调查人群携带或曾经携带脑膜炎奈瑟菌，但阴性者不能排除其携带脑膜炎奈瑟菌的可能。D.1.2检测脑膜炎奈瑟菌的另一个常用靶基因是sodC,该基因几乎存在于所有脑膜炎奈瑟菌，许多嗜血杆菌也含有该基因，而健康人鼻咽部嗜血杆菌携带率较高。D.1.3ctrA基因检测ctrA基因Real-timePCR引物和探针序列见表D.1。表D.1ctrA基因Real-timePCR引物和探针序列种属名称目的基因引物/探针名称引物和探针序列(5'-3')NmctrActrA-fTGTGTTCCGCTATACGCCATTctrA-rGCCATATTCACACGATATACCctrA-Pb(FAM)AACCTTGAGCAA"T"CCATTTATCCTGACGTTCT注：“T”标记淬灭基团BHQ1。D.1.4sodC基因检测sodC基因Real-timePCR引物和探针序列见表D.2。表D.2sodC基因Real-timePCR引物和探针序列种属名称目的基因引物/探针名称引物和探针序列(5'-3')NmsodC-fGCACACTTAGGTGATTTACCTGCATsodC-rCCACCCGTGTGGATCATAATAGAsodC-Pb(FAM)CATGATGGCACAGCAACAAATCCTGTTT(BHQ1)D.2血清群特异性Real-timePCR检测血清群特异性Real-timePCR引物和探针序列见表D.3。DB65/T4680—20238表D.3血清群特异性Real-timePCR引物和探针序列引物和探针序列(5'-3')AAAAATTCAATGGGTATATCACGAAATATGGTGCAAGCTGGTTTCAAFAM-CTAAAAG"T"AGGAAGGGCACTTTGTGGCABACCAGCCGAGGGTTTATTTFAM-AAGAGATGGGYAACAAC"T"ATGTAATCFAM-TTTCAATGC"T"AATGAATACCACCGTTTTXFAM-TGTTTGCCCACATGAYFAM-TATGGTG"T"ACGATATCCCTATCCTTGCCTWFAM-AAATA"T"GGAGCGAATGATTACAGTAACT采用市售合格的DNA提取试剂盒进行提取，具体操作步骤按照说明书。提取的DNA,可于—20℃以下长期保存。D.4.1PCR反应体系以20μL为例，2×PCR反应混合物10μL,上下游引物、探针各2μL(ctrA上下游引物和探针终浓度分别为0.9μmol/L、0.9μmol/L、0.1μmol/L,sodC上下游引物和探针终浓度分别为0.3μmol/L、0.6μmol/L、0.1μmol/L,分群引物和探针终浓度分别为0.6μmol/L、0.6μmol/L、0.1μmol/L),根据荧光PCR仪的要求确定是否加入参比荧光Rox及加入量，DNA模板2μL,超纯水补齐至20μL。D.4.2反应条件：a)退火温度60℃,共50个循环；b)其他反应条件根据所使用的2×PCR反应混合物的说明书进行调整。D.5结果分析DB65/T4680—20239D.5.1扩增图应呈光滑的S型曲线，如果曲线的形状改变，应判断为阴性或者重新检测。D.5.2手动拖拽阈值线至基线上方后读取Ct值，根据以下标准判断检测结果：a)Ct值小于等于36为阳性；b)Ct值大于等于40为阴性；c)Ct值介于36～40,结果为可疑，应重新检测。D.5.3重新检测时可采取以下两种方法：a)将模板稀释4~10倍和用4μL模板代替2μL两种方法重复检测。如果Ct值≤36,该样品判断为阳性，否则为阴性。b)同时设置三个平行孔检测，如果两个或三个孔出现良好的扩增曲线，判断为阳性，否则为阴性。脑膜炎奈瑟菌培养E.1培养基的准备E.1.1双抗哥伦比亚血平板的配制E.1.1.1所需试剂哥伦比亚粉、万古霉素、多粘菌素B、脱纤维羊血。E.1.1.2配制方法E.1.1.2.1量取500ml纯水，倒入锥形瓶中，再称取19.5g的哥伦比亚干粉，放入锥形瓶中，充分溶解，用一层纱布裹住瓶口，再用牛皮纸或者锡箔纸裹住瓶口，置于121℃,103kPa~137kPa,高压15min。E.1.1.2.2将水浴锅的温度提前调至48℃,高压完后，将锥形瓶放入水浴锅中。E.1.1.2.3待冷却至48℃,无菌操作往锥形瓶中加入万古霉素(终浓度为6.6mg/L)、多粘菌素B(终浓度为8.4万unit/L)。E.1.1.2.4按照每500ml加25ml的标准，加入脱纤维羊血。E.1.1.2.5轻轻摇晃至均匀，将锥形瓶和培养皿(90mm)放在安全柜或超净工作台内(使用前需紫外消毒半小时，才可使用),右手托起锥形瓶瓶底，左手打开培养皿盖，右手迅速将培养基倒入培养皿中，每皿约倒入20ml,以铺满皿底为度。铺放培养基后放置2h左右，待培养基凝固后，倒置过来，4℃保存。E.1.1.3质量控制E.1.1.3.1无菌实验随机选取两块制成的培养基，37℃,5%CO₂条件下培养24h。24h后检查，是否有菌落生长，如无菌生长，即可继续开展生长实验。E.1.1.3.2生长实验将质控菌株接种于制备的培养基上，37℃,5%CO2条