T-SDAA 0065-2023 SPF 鸭微生物学监测技术规范

ICS65.020.30本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的规则起草。本文件由山东省畜牧协会提出并归口。本文件中可能涉及到专利，本文件发布机构不承担识别专利的责任。本文件起草单位：山东省农业科学院家禽研究所、山东省农业科学院畜牧兽医研究所、中国牧工商集团有限公司、山东第一医科大学、山东和康源生物育种股份有限公司、山东昊泰实验动物繁育有限公司本文件主要起草人：徐怀英、李玉峰、秦卓明、黄兵、马秀丽、于可响、李峰、张世栋、亓丽红、董雯雯、袁小远、张玉霞、孟凯、李桂明、马保臣、王可洲、王胜、李丽。本文件为首次发布。T/SDAA0065-2023SPF鸭微生物学监测技术规范本文件规定了SPF鸭的微生物学监测术语和定义、监测要求、检测方法、监测程序、样品采集、结果判定及档案保存的基本要求。本文件适用于SPF鸭和鸭蛋（胚）的微生物学监测。2.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而成为本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB14925实验动物环境及设施GB/T16550新城疫诊断技术GB/T17999.2SPF鸡微生物学监测第2部分：SPF鸡红细胞凝集抑制试验GB/T17999.6SPF鸡微生物学监测第6部分：SPF鸡酶联免疫吸附试验GB/T22332鸭病毒性肠炎诊断技术NY/T563禽霍乱（禽巴氏杆菌病）诊断技术NY/T1247禽网状内皮组织增殖症诊断技术NY/T2838禽沙门氏菌病诊断技术NY/T3188鸭浆膜炎诊断技术NY/T3233鸭坦布苏病毒病诊断技术NY/T4027I群禽腺病毒检测方法SN/T1182禽流感检疫技术规范DB37/T3821鸭新型呼肠孤病毒病诊断技术规范DB37/T4436禽白血病病毒与禽网状内皮组织增殖病病毒联合净化技术规程世界动物卫生组织（WOAH）陆生动物诊断试验与疫苗手册3.术语和定义3.1无特定病原鸭specificpathogenfreeduck，SPFduck在符合GB14925中规定的屏障环境或隔离环境等严格控制的饲养条件下，具有清晰的遗传背景和良好的生产性能，且其携带的病原微生物或血清学监测指标，符合本标准规定的微生物监测要求的鸭群。T/SDAA0065-20233.2饲养单元raisingunit相同饲养环境内的最小鸭饲养设施，如屏障环境内的一栋鸭舍或一台鸭饲养隔离器。4监测要求4.1监测项目的分类4.1.1必须检测项目：在进行实验动物评价时必须检测的项目。4.1.2必要检测项目：在下列情况下必须检测的项目，如引进SPF鸭（蛋）时、种群繁育时、怀疑本病流行时、申请实验动物生产/使用许可证和申请实验动物许可证时。4.2监测项目SPF鸭病原微生物监测项目及其方法见表1。表1SPF鸭的微生物学监测项目及其方法序号病原微生物方法要求1鸭沙门氏菌ducksallmonellaIA，SPA，PCR2禽多杀性巴氏杆菌avianpasteurellamultocidaCO，IA○3鸭疫里默氏杆菌riemerellaanatipestiferIA，PCR4禽流感病毒avianinfluenzaviruseAGP，HI，RT-PCR5禽1型副黏病毒avianparamyxovirustype1HI，RT-PCR○6鸭肠炎病毒duckenteritisvirusPCR7鸭甲型肝炎病毒1型duckhepatitisAvirusRT-PCR，SN8鸭甲型肝炎病毒3型duckhepatitisAvirusRT-PCR，SN9鸭腺病毒A型duckadenovirusA（EDSV）HII群禽腺病毒fowladenovirusRT-PCR鸭坦布苏病毒tembusuvirusRT-PCR鸭细小病毒duckparvovirusReal-timePCR，SN鸭圆环病毒duckcircovirusPCR鸭呼肠孤病毒duckreovirusRT-PCR网状内皮组织增生病病毒reticuloendotheliosisvirusRT-PCR○禽白血病病毒avianleucosisvirusRT-PCR，ELISA○注1：“●”为必须检测项目，要求阴性；“○”为必要检测项目，要求阴性。注2：IA——病原分离；SPA——血清平板凝集试验；CO——临床症状观察；HI——血凝抑制试验；ELISA——酶联免疫吸附试验；RT-PCR——反转录-聚合酶链式反应；PCR——聚合酶链式反应；Real-timePCR——荧光定量聚合酶链式反应；SN——血清中和试验。5检测方法5.1鸭沙门氏菌按照NY/T2838规定执行。T/SDAA0065-20235.2禽多杀性巴氏杆菌按照NY/T563或WOAH《陆生动物诊断试验与疫苗手册》（2022）规定执行。5.3鸭疫里默氏杆菌按照DB37/T3880规定执行。5.4禽流感病毒按照SN/T1182规定执行。5.5禽1型副黏病毒按照GB/T16550规定执行。5.6鸭肠炎病毒按照GB/T22332或WOAH《陆生动物诊断试验与疫苗手册》（2022）3.3.7方法进行检测。5.7鸭甲型肝炎病毒1型按照WOAH《陆生动物诊断试验与疫苗手册》（2022）3.3.8方法进行检测。5.8鸭甲型肝炎病毒3型按照WOAH《陆生动物诊断试验与疫苗手册》（2022）3.3.8方法进行检测。5.9鸭腺病毒A型按照GB/T17999.8第2部分规定执行。5.10禽腺病毒I群按照NY/T4027规定执行。5.11鸭坦布苏病毒按照NY/T3233规定执行。5.12网状内皮组织增生症病毒按照NY/T1247规定执行。5.13禽白血病病毒按DB37/T4436或按GB/T17999.8中第6部分规定执行。T/SDAA0065-20235.14鸭细小病毒按照附录D规定执行。5.15鸭圆环病毒按照附录E规定执行。5.16鸭呼肠孤病毒按照附录F规定执行。6监测程序监测流程见图1图1SPF鸭微生物学监测流程示意图6.1监测前的准备对被检鸭编号。临床观察监测是否感染多杀性巴氏杆菌，临床症状参见附录A。6.2抽样比例和监测项目6.2.1鸭群刚开产或留种蛋前，应对全群鸭采样，检测本文件规定的所有项目。6.2.2对刚开产的鸭进行淋巴白血病病毒感染检测时，每个饲养单元抽检鸭蛋的个数占母鸭数的30%。6.2.3其它时期的鸭群（含育成鸭或开产后的鸭），每个饲养单元按5%~10%的比例抽样，每单元采样量最低不少于8份，监测本文件规定的必须项目。T/SDAA0065-20232年。6.3监测频率首次监测从8周~10周龄开始。常规检测时，每隔4周~8周，检测本文件规定的所有必须项目。有病原微生物感染危险时，随时进行相关项目的检测。7样品7.1样品采集7.1.1血清样品无菌采集鸭的血液，每只约1~2mL，采血方法及血清处理参见附录B，编号并填写相应采样单。待血液凝固析出血清后，用于HI或ELISA检测，。7.2蛋清样品将种蛋钝端消毒后，用镊子将蛋壳敲破，将移液器的吸头从破壳处沿蛋壳内壁伸入蛋内约1cm，吸取1mL蛋清，储存于-20℃冰箱备用。7.3拭子样品7.3.1采集咽喉拭子时将拭子探入喉头及上腭裂来回刮2~3次并旋转，取出分泌液。7.3.2采集泄殖腔拭子时将拭子探入泄殖腔至少旋转3圈并沾取少量粪便。7.3.3采样后将拭子放入盛有1.2mL样品稀释液的2mL采样管中，样品稀释液配制方法参见附录C。7.2样品保存和运输样品采集后，编号并填写采样单。放置在加入预冷冰袋的保温箱中，应尽快送实验室处理，或在4℃存放不超过2d。7.3取/送检样品方法取/送检样品方法应编号标识、低温送达检测单位，并附送检单，写明鸭群数量、样品名称、检测要求及样品数量等。8结果判定所有监测项目均为阴性的，判为合格，监测结果如有1项以上（含1项）为阳性，则判为不合格。9记录与档案保存检测样品、检测试剂及检测结果等均需详细填写检测记录和最终报告，归档保留不低于T/SDAA0065-2023（资料性）鸭感染多杀性巴氏杆菌的临床症状A.1鸭感染多杀性巴氏杆菌有急性和慢性两种不同程度的临床症状，以急性型较多。A.2急性型表现为发热、厌食、羽毛杂乱，脖颈蜷缩不愿伸直，眼睛时长处于紧闭状态，口腔有黏液性流出物，腹泻严重，呼吸加快，死亡非常迅速。临死前有发绀现象，以头部无毛处最明A.3慢性型以局部感染为主。口鼻分泌物增多、伴发关节炎等症状。A.4出现上述症状之一的鸭群，即判为多杀性巴氏杆菌疑似感染，应利用其他方法进行复核性监测。T/SDAA0065-2023（资料性）鸭血清的采集、制备及非特异性处理B.1用75%酒精棉球对鸭翅下静脉进行消毒。B.2一次性注射器抽取鸭血1mL~2mL，37℃静置1h，4℃静置2h。B.3将凝固的血块及析出的液体置无菌离心管中，4000r/min离心5min，取上清，即为鸭血清。B.41%鸭红细胞可直接进行血凝抑制试验。如用鸡红细胞，需用鸡红细胞对待检鸭血清进行吸附，每0.5mL鸭血清中加入0.025mL50%鸡红细胞，轻摇后静置至少30min，800g离心2min~5min，收集上清液，可立即进行检测或-20℃贮存待检。T/SDAA0065-2023（资料性）样品稀释液的配制C.1A液0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液。NaH2PO4·H2O27.6g，溶于水中，最后定容至1000mL。C.2B液0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液。Na2HPO4·2H2O35.6g，加水溶解，最后定容至1000mL。C.30.01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）（含抗生素和稳定剂）的配制取A液14mL，B液36mL，加NaCl8.5g，加水定容至1000mL，经高压灭菌，冷却后，无菌条件下加入至终浓度青霉素（2000U/mL）、链霉素（2000U/mL）、霉菌抑制素（1000U/mL）、甘油（30%）或牛血清白蛋白（5mg/mL）。上述抗生素浓度适用于咽喉拭子，如泄殖腔拭子的保存液，抗生素浓度可提高至5倍。水为GB/T6682规定的三级水。T/SDAA0065-2023（规范性）番鸭细小病毒和鹅细小病毒PCR检测方法D.1适用范围适用于检测鸭组织、分泌物、排泄物、鸭胚培养物等物质中番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）核酸。D.2仪器设备PCR扩增仪及配套反应管。高速台式冷冻离心机（离心速度不低于12000r/min）。微量移液器（2.5μL、10μL、100μL、1000μL）及配套吸头与1.5mL离心管。电泳仪。电泳槽。紫外凝胶成像仪。D.3试剂推荐的PCR引物序列：MDPV-235-F3：5'-CTTGAGCACGATAAAGCG-3'，MDPV-235-F4：5'-GATCTGTTAGTTTTCCACTACTC-3'；GPV-194-F1：5'-ATAGCCTCCAACACGACCA-3'，GPV-194-F2：5'-CGCACTGACTTCCTCGGT-3'。DEPC水。无水乙醇。阴性对照为DEPC水。阳性对照为番鸭细小病毒和鹅细小病毒重组质粒。D.4DNA提取可选市售商品化DNA提取试剂盒，按说明书进行。D.5PCR操作取2.5μL提取的DNA加入PCR反应液中，置于PCR仪中，循环参数为：94℃预变性3min；94℃30s、52℃45s、72℃45s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。D.6电泳PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行分析。D.7结果判定在阳性对照出现相应扩增条带、阴性对照无此扩增条带时判定结果。出现预期235bp大小的扩增片段时，判定为MDPV核酸检测阳性，出现预期194bp大小的扩增片段时，判定为GPV核酸检测阳性，无上述条带时判定为阴性。T/SDAA0065-2023（规范性）鸭圆环病毒PCR检测方法E.1适用范围适用于检测禽组织、分泌物、排泄物、鸡胚培养物等物质中鸭圆环病毒（DCV）核酸。E.2仪器设备PCR扩增仪及配套反应管。高速台式冷冻离心机（离心速度不低于12000r/min）。微量移液器（2.5μL、10μL、100μL、1000μL）及配套吸头与1.5mL离心管。电泳仪。电泳槽。紫外凝胶成像仪。E.3试剂推荐的PCR引物序列：DCV-433-T1：5'-CCTTGAGGAGTCGCTGG-3'，DCV-433-T2：5'-CCAACCATAAAAGTCGTCCA-3'。DEPC水。无水乙醇。阴性对照为DEPC水。阳性对照为鸭圆环病毒重组质粒。E.4DNA提取可选市售商品化DNA提取试剂盒，按说明书进行。E.5PCR操作取2.5μL提取的DNA加入PCR反应液中，置于PCR仪中，循环参数为：94℃预变性3min；94℃30s、52℃45s、72℃45s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。E.6电泳PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行分析。E.7结果判定在阳性对照出现相应扩增条带、阴性