DB22-T 1997-2014 饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的测定液相色谱-串联质谱法

DB22T19972014饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的测定液相色谱串联质谱法1范围本标准规定了饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星残留量的液相色谱串联质谱测定方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和预混合饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星含量的测定。本方法的检出限：恩诺沙星为5.0μg/kg，环丙沙星为5.0μg/kg，诺氟沙星为5.0μg/kg；定量限：恩诺沙星为10.0μg/kg，环丙沙星为10.0μg/kg，诺氟沙星为10.0μg/kg。2原理试样中的恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星用乙腈磷酸盐缓冲溶液提取，经HLB固相萃取柱净化，采用液相色谱串联质谱法测定，外标法定量。3试剂和材料除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1乙腈：色谱纯。3.2甲醇：色谱纯。3.3甲酸：色谱纯。3.4磷酸二氢钾。3.5磷酸氢二钠。3.6乙二胺四乙酸二钠（EDTA2Na）。3.7氢氧化钠。3.8盐酸。3.9磷酸盐缓冲溶液（0.05mol/L，pH=7.0）：称取6.80g磷酸二氢钾和3.55g磷酸氢二钠，用水溶解并定容至1000mL，用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH至7.0±0.1。3.10EDTAMcIlvaine缓冲溶液：称取12.9g柠檬酸、10.9g磷酸氢二钠和37.2gEDTA2Na，用水溶解并定容至1000mL，用氢氧化钠溶液调节pH至4.0±0.1。3.11提取液：乙腈磷酸盐缓冲溶液（3.9）（20+80，v/v）。3.12淋洗液：甲醇水（10+90，v/v）。3.13洗脱液：甲醇甲酸（95+5，v/v）。3.14标准品：恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星标准品，纯度≥98%。3.15标准储备溶液：分别准确称取恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星标准品各10.0mg，用甲醇溶解并定容至100mL，配制成100μg/mL的标准储备溶液，18℃避光保存，有效期3个月。3.16混合标准中间溶液：分别准确吸取1.00mL恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星标准储备溶液（3.15）于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成1.0μg/mL的混合标准中间溶液，4℃避光保存，有效期1个月。4仪器和设备4.1液相色谱串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。4.2分析天平：感量0.1mg和0.01g。4.3离心机：转速≥10000r/min。4.4涡旋混合器。4.5超声波清洗器。4.6氮吹仪。4.7固相萃取装置。4.8HLB固相萃取柱：200mg/6mL，或相当者。4.9有机相滤膜：0.22μm。4.10pH计：精度±0.02。4.11旋转蒸发仪。4.12恒温水浴锅。5试样制备与保存5.1试样制备取具有代表性的饲料样品约500g，用粉碎机粉碎，使其全部通过0.45mm筛网，混匀，装入洁净容器中，密封备用。5.2试样保存试样在室温下保存，如需长期保存，应置于18℃冰箱中冷冻保存。6分析步骤6.1提取称取5.0g（精确至0.01g）试样于50mL聚丙烯离心管中，加入20mL提取液（3.11），涡旋混合2min，超声提取15min，以10000r/min离心10min，取上清液于另一离心管中。残渣重复提取一次，合并上清液，待净化。6.2净化6.2.1HLB固相萃取柱活化：依次用5mL甲醇、5mL水活化HLB固相萃取柱，保持柱体湿润。6.2.2上样：将6.1中的提取液以12mL/min的流速通过HLB固相萃取柱。6.2.3淋洗：用5mL淋洗液（3.12）淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，抽干5min。6.2.4洗脱：用5mL洗脱液（3.13）洗脱，收集洗脱液于10mL玻璃试管中。6.2.5浓缩：将洗脱液在40℃水浴中用氮气吹至近干，用1.0mL甲醇水（20+80，v/v）溶解残渣，涡旋混合1min，经0.22μm有机相滤膜过滤，供液相色谱串联质谱测定。6.3测定a)色谱柱：C18柱，2.1mm×100mm，1.7μm，或相当者；b)流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；c)梯度洗脱程序：0min，10%B；05min，10%30%B；58min，30%90%B；810min，90%B；1010.5min，90%10%B；10.515min，10%B；d)流速：0.3mL/min；e)柱温：40℃；f)进样量：5μL。a)离子源：电喷雾离子源（ESI）；b)扫描方式：正离子扫描；c)检测方式：多反应监测（MRM）；d)电喷雾电压：5500V；e)雾化气压力：50psi；f)干燥气流速：10L/min；g)干燥气温度：550℃；h)碰撞气：高纯氮气；i)定性离子对、定量离子对、碰撞能量和去簇电压见表1。表1恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的质谱参数|化合物名称|母离子(m/z)|定性离子对(m/z)|定量离子对(m/z)|碰撞能量(eV)|去簇电压(V)|||||||||恩诺沙星|360.1|360.1→316.1|360.1→342.1|25,20|80||环丙沙星|332.1|332.1→314.1|332.1→288.1|28,35|85||诺氟沙星|320.1|320.1→302.1|320.1→276.1|22,30|75|6.3.3定性测定按照上述条件测定试样和混合标准工作溶液，如果试样中色谱峰的保留时间与标准溶液中相应组分色谱峰的保留时间一致，且试样色谱图中定性离子的相对丰度与浓度接近的标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，则可判定为阳性检出。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差|相对离子丰度（%）|>50|>2050|>1020|≤10||||||||允许的相对偏差（%）|±20|±25|±30|±50|6.3.4定量测定6.4空白试验除不加试样外，均按上述测定步骤进行。7结果计算与表述试样中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的残留量按式（1）计算：X=(c×V)/m式中：X——试样中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；c——从标准工作曲线上查得的试样溶液中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V——试样溶液最终定容体积，单位为毫升（mL）；m——试样质量，单位为克（g）。计算结果保留三位有效数字。8精密度8.1重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。8.2再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的