凝血因子Ⅷ抑制物定量检测专家共识2025

凝血因子Ⅷ抑制物定量检测专家共识2025凝血因子Ⅷ（factorⅧ，FⅧ）抑制物作为获得性血友病A（acquiredhemophiliaA，AHA）的诊断指标，同时也是接受外源性FⅧ输注后血友病A（hemophiliaA，HA）患者是否产生抑制物的关键监测指标。由此可见，FⅧ抑制物的定量检测在这些疾病的鉴别诊断、治疗方案选择及治疗效果监测等环节中均起着至关重要的作用。2018年，中华医学会血液学分会血栓与止血学组及中国血友病协作组联合制定了《凝血因子Ⅷ/Ⅸ抑制物诊断与治疗中国指南（2018年版）》

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1］

，详细介绍了凝血因子抑制物产生的危险因素及治疗方案，但在实验室检测方面仅简单提及了FⅧ抑制物的检测方法，并未明确标准化操作及报告流程。此后，多个指南及专家共识亦未能在此方面给出相对专业的意见或建议

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2,3,4］

。然而，当前FⅧ抑制物定量检测存在着检测过程中影响因素相对较多、自动化程度相对较低等问题，同时检验医师及技师对检测结果计算的相关概念较为模糊，加之新型非因子治疗药物的使用，使得FⅧ抑制物定量检测的标准化面临着巨大的挑战。为了解各实验室FⅧ抑制物定量检测现状及存在的问题，中华医学会检验医学分会临床血液体液学组联合中国血友病青年协作组设计并发布了调研问卷，最终共收到159家实验室的反馈。调研问卷结果显示在FⅧ抑制物定量检测的相关概念、检测步骤和结果计算及解释等方面亟待规范化和标准化。结合调研问卷结果，学组与协作组查阅国内外相关文献，整理并总结国内血栓与止血领域专家的临床实践经验，共同编写了本共识。本共识主要从相关概念、启动检测的时机、检测方法、检测步骤、结果计算及解释和注意事项等方面进行介绍，以期推进我国FⅧ抑制物定量检测的标准化，进而推广至各凝血因子抑制物定量检测的标准化，同时亦希望能给血栓与止血领域的临床医师、检验医师及技师在临床工作中带来指导和帮助。本共识编写工作组由来自9个省（直辖市）的11家医疗机构共16位专家组成。所有专家均声明不存在利益冲突，并签署了《作者利益冲突公开声明》。编写工作组专家在PubMed、中国期刊全文数据库、中文科技期刊数据库和中国学术期刊数据库中检索了相关文献。执笔专家结合临床实践经验和国内外相关文献，形成共识初稿。通过多轮讨论，编写工作组专家对初稿提出修改意见和建议，执笔专家进一步完善形成共识修改稿。在此基础上，所有编写工作组专家凝练提出9条专家共识，最终形成定稿。基于德尔菲法，共识推荐强度根据编写工作组专家投票表决结果，分为强推荐、推荐和弱推荐3个级别。其中，同意率（即同意的专家人数比例）90%为强推荐，80%~90%为推荐，80%为弱推荐。本共识已在国际实践指南注册与透明化平台（

http：//）注册，注册号为PREPARE-2025CN553。一、FⅧ抑制物的相关概念（一）基本概念将不同稀释度的患者血浆与等量的正常混合血浆（normalpooledplasma，NPP）混合后，置于37℃孵育2h后测定混合样本的剩余FⅧ活性（factorⅧactivity，FⅧ∶C）。能使NPP的FⅧ∶C减少50%的FⅧ抑制物含量称为1个Bethesda单位（Bethesdaunit，BU），此时患者血浆稀释度的倒数即为FⅧ抑制物滴度，报告单位为BU/ml

［

1］

。同一患者在一周至四周内连续两次检出≥0.6BU/ml的FⅧ抑制物，则为FⅧ抑制物阳性

［

1，4］

。（二）分类FⅧ抑制物可分为HA患者的抗FⅧ同种抑制物及AHA患者的抗FⅧ自身抑制物。前者多为1型抑制物，而后者多为2型抑制物，两者呈现出截然不同的动力学特征

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3，5］

。此外，根据FⅧ抑制物滴度，可将其分为低滴度抑制物（即抑制物滴度5.0BU/ml）和高滴度抑制物（即抑制物滴度≥5.0BU/ml）

［

4］

。二、启动FⅧ抑制物定量检测的时机（一）HA对于首次拟确诊的HA患者（尤其是轻型和中间型患者），为与AHA进行鉴别诊断，在接受替代治疗前需进行FⅧ抑制物定量检测

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3］

。对于已确诊的HA患者，除预防治疗时需定期监测FⅧ抑制物外，若有以下情况，应及时进行FⅧ抑制物定量检测：（1）FⅧ替代治疗效果较既往欠佳；（2）在规范预防治疗下，出血频率增加或者仍有靶关节出血；（3）高强度输注FⅧ后；（4）手术前；（5）手术后FⅧ替代治疗疗效欠佳；（6）轻型和中间型HA患者出血表现加重

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4，6,7,8］

。具体情况可参考《血友病合并抑制物诊断与治疗中国指南（2023年版）》

［

4］

。对于抑制物持续阳性的重型HA患者，应立即接受免疫耐受诱导治疗（immunetoleranceinduction，ITI）

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4］

。FⅧ抑制物定量检测对于ITI的疗效预测、剂量选择及疗效评估等均有重要的临床意义。具体内容可参考《血友病合并抑制物诊断与治疗中国指南（2023年版）》

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4］

。（二）AHA对于拟确诊AHA的患者，应进行FⅧ抑制物定量检测以明确诊断。对于已确诊的AHA患者，在治疗前6周，门诊患者应每周进行1次FⅧ抑制物定量检测，住院患者应每周进行2次FⅧ抑制物定量检测

［

1］

。完全缓解（即FⅧ抑制物滴度0.6BU/ml，FⅧ∶C≥50%，免疫抑制剂停用或恢复至发病前剂量）后可根据临床需求进行FⅧ抑制物定量检测

［

3］

。三、FⅧ抑制物定量检测方法（一）按检测原理区分FⅧ抑制物定量检测本质上是剩余FⅧ∶C检测，从检测原理上可分为一期凝固法和发色底物法。1.一期凝固法：一期凝固法主要是基于检测待测样本对乏FⅧ基质血浆活化部分凝血活酶时间（activatedpartialthromboplastintime，APTT）的纠正能力，通过检测混合后血浆的APTT可计算得到样本的FⅧ∶C结果

［

9］

。一期凝固法目前是国内乃至全世界应用最广泛的FⅧ∶C检测方法。但该方法可能受其他凝血因子抑制物、狼疮抗凝物质和肝素等干扰APTT纠正能力的物质影响。此外，随着HA新型非因子治疗药物（如艾美赛珠单抗）的使用，一期凝固法亦不能用于该人群的FⅧ抑制物定量检测

［

10］

。2.发色底物法：发色底物法的原理是基于检测FⅧ作为辅因子与活化的凝血因子Ⅸ形成的复合物活化凝血因子Ⅹ的能力，通过检测生成的活化凝血因子Ⅹ的量来计算样本的FⅧ∶C结果

［

9］

。该方法抗干扰能力较一期凝固法强，可应用于FⅧ抑制物与其他凝血因子抑制物或狼疮抗凝物质的鉴别诊断

［

3，10］

。另外，牛源性发色底物法（即试剂为牛源性试剂）可应用于使用艾美赛珠单抗预防治疗的HA患者的FⅧ抑制物定量检测

［

4，10］

。（二）按检测体系区分Lawrence和Johnson

［

11］

于1941年首次报道了一例产生FⅧ抑制物的HA病例。此后又有多例FⅧ抑制物阳性的病例先后被报道，但报道中的FⅧ抑制物定量检测方法却大相径庭。直至1975年，Kasper等

［

12］

提出了一种标准化程度较高的检测方法，即Bethesda法。1995年Verbruggen等

［

13］

在Bethesda法的检测体系上进行改良，进而提出了Nijmegen法。相比Bethesda法，Nijmegen法提高了FⅧ抑制物定量检测的特异性。此后，Nijmegen法被国际血栓与止血学会推荐为FⅧ抑制物定量检测的参考方法

［

14］

。两种方法的区别主要在检测体系的不同，具体内容将在本共识后续部分进行详细介绍。（三）按正常混合血浆的来源区分国际上，猪重组凝血因子Ⅷ（recombinantporcinefactorⅧ，rpFⅧ）已被用于成人AHA患者按需治疗和出血事件的控制

［

5］

。对于该人群而言，需额外检测抗rpFⅧ抑制物。根据NPP的来源，可将FⅧ抑制物定量检测分为抗人FⅧ抑制物定量检测和抗rpFⅧ抑制物定量检测。四、FⅧ抑制物定量检测步骤（一）样本采集及制备应使用含0.109mol/L（3.2%）枸橼酸三钠抗凝剂（1∶9抗凝）抗凝管进行样本采集。若患者的红细胞比容≥55%，应按要求进行抗凝剂或采血量的调整

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9，15］

。样本采集后应确认无血凝块存在，宜在常温条件下1h内送检，采用规定的离心速度和离心时间［室温（18~24℃）、1500×

g、不少于15min］离心，以得到乏血小板血浆（血小板计数10×10

9/L），建议当天内完成检测。若不能及时检测，应尽快将离心分离后的血浆置于-20℃冰箱（最多可保存2周）或-70℃冰箱（最多可保存6个月）保存。检测前应将样本置于37℃水浴快速复融至少4~5min并充分混匀。（二）样本灭活在FⅧ抑制物定量检测前，应将样本置于56℃孵育30min以灭活样本中残留的FⅧ，减少残留的FⅧ对FⅧ抑制物定量检测结果的干扰

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7，14］

。灭活后，需采用一定的离心速度和离心时间（如4000×

g、2min或1500×

g、不少于15min等）离心，取上清液进行后续的样本稀释

［

14］

。共识1所有待测乏血小板血浆均应经过56℃孵育30min灭活。灭活后采用一定的离心速度和离心时间离心，取上清液进行后续的样本稀释。推荐强度：推荐，同意率：81.25%（13/16）（三）正常混合血浆的准备当检测抗人FⅧ抑制物时，可使用商品化的NPP，商品化NPP的使用和保存应按照制造商说明书进行操作。若无法获得商品化NPP，实验室亦可自制NPP。自制NPP时需注意：（1）应选择至少20份（男女比例1∶1）常规凝血试验结果均正常的血浆混合制得；（2）避免选择感染、肿瘤、创伤、术后、妊娠、新生儿、肝脏疾病、自身免疫性疾病及进行抗凝治疗等人群的样本；（3）避免选择性状存在溶血、凝块、黄疸和脂血等情况的样本；（4）从每份样本中采集足够的血浆以获得足够的NPP

［

2］

；（5）自制NPP的FⅧ∶C结果应在95%~105%之间

［

14］

。混合制得NPP后需采用一定的离心速度和离心时间（如1500×

g、15min等）再次离心。可在每次FⅧ抑制物定量检测前制备新鲜的NPP，抑或使用冻存的NPP。冻存及复融的要求可参考《活化部分凝血活酶时间延长混合血浆纠正试验操作流程及结果解读中国专家共识》

［

2］

。复融后应重新检测NPP的FⅧ∶C，结果需在95%~105%之间才可继续使用。当检测抗rpFⅧ抑制物时，可使用商品化的rpFⅧ

［

5］

作为NPP，商品化rpFⅧ的使用和保存应按照制造商说明书进行操作。使用商品化的乏FⅧ血浆稀释rpFⅧ，使rpFⅧ活性接近100%。共识2实验室自制NPP的FⅧ∶C结果应在95%~105%之间。推荐强度：强推荐，同意率：93.75%（15/16）（四）样本稀释及处理1.Bethesda法：使用pH=7.4的0.1mol/L咪唑缓冲液将样本稀释至各稀释度（如1/2、1/4、1/8、1/16等），最大稀释度可根据实际情况调整。向0.1mol/L咪唑缓冲液（后称“标准管”）和原倍及各稀释度的样本（后称“检测管”）中加入等量的NPP，混匀后闭盖置于37℃孵育2h

［

7，14，16］

。原倍检测管的稀释度为1，1/2稀释的检测管的稀释度为2，以此类推。具体操作步骤见

图1

。图1

FⅧ抑制物定量检测样本的稀释及处理过程2.Nijmegen法：Nijmegen法与Bethesda法检测体系的不同点在于：（1）使用乏FⅧ血浆作为样本稀释液；（2）使用0.1mol/L的咪唑缓冲液将NPP的pH调整至7.4

［

7，14，16］

。（五）剩余FⅧ∶C检测可通过“标准管与检测管分别检测FⅧ∶C”或“使用标准管制定标准曲线”两种方法中任意一种进行剩余FⅧ∶C检测。1.标准管与检测管分别检测FⅧ∶C：分别检测标准管与检测管的FⅧ∶C，根据公式（1）计算检测管的剩余FⅧ∶C（%）。2.使用标准管制定标准曲线：FⅧ抑制物定量检测的标准曲线制定可参考FⅧ∶C检测。将标准管作为参考血浆（靶值定义为100%）制作标准曲线。FⅧ抑制物定量检测的标准曲线中FⅧ∶C应至少覆盖25%~75%。标准曲线的线性回归方程的r值应在0.998~1.000，斜率应在0.9~1.1

［

9］

。若使用商品化的NPP，在试剂批号更换、NPP批号更换或仪器设备调整等情况下需重新制定标准曲线。使用冻存的实验室自制NPP前，除需确认是否有试剂批号更换或仪器设备调整等情况外，还需在复融NPP后重新检测FⅧ∶C。若结果在95%~105%之间，可省略标准曲线制定这一步骤。使用新鲜的实验室自制NPP时，需重新制定标准曲线。在制定新的标准曲线或确认历史标准曲线适用之后，开始检测管剩余FⅧ∶C的检测。3.起始检测管：起始检测管的选择可结合患者病史决定。若为首次进行FⅧ抑制物定量检测或无FⅧ抑制物阳性史的患者，应将原倍检测管作为起始检测管。若为有FⅧ抑制物阳性史的患者，可参考历史检测结果选择合适的检测管作为起始检测管。（六）结果判断检测管的剩余FⅧ∶C结果在25%~75%范围内（除原倍检测管的剩余FⅧ∶C75%外）视为有效结果。若检测管的剩余FⅧ∶C50%，则应进一步选择更低稀释度的检测管（直至原倍检测管）进行剩余FⅧ∶C检测，直至找到剩余FⅧ∶C≤50%的检测管。若检测管的剩余FⅧ∶C50%，则应进一步选择更高稀释度的检测管进行剩余FⅧ∶C检测，直至找到剩余FⅧ∶C≥50%的检测管。若当次制备的最高稀释度的检测管的剩余FⅧ∶C仍50%或最低稀释度的检测管的剩余FⅧ∶C仍50%（除原倍检测管的剩余FⅧ∶C50%外），需从样本稀释及处理起，调整合适的稀释度后重新进行FⅧ抑制物定量检测

［

16,17,18］

。选择剩余FⅧ∶C最接近50%的检测管的结果进行结果计算。共识3剩余FⅧ∶C结果应在25%~75%范围内，选择最接近50%的检测管的结果进行结果计算。推荐强度：强推荐，同意率：100.00%（16/16）FⅧ抑制物定量检测完整流程示意图见

图2

。图2

FⅧ抑制物定量检测完整流程图五、结果计算及解释（一）结果计算根据公式（2）

［

14，18］

，得到FⅧ抑制物滴度计算系数。将FⅧ抑制物滴度计算系数代入公式（3）中计算样本的FⅧ抑制物滴度。（二）参考范围目前，国内外较为公认的具有临床意义的FⅧ抑制物滴度为“≥0.6BU/ml”

［

1，3,4，19,20］

，本共识建议在报告FⅧ抑制物定量检测结果时可将参考范围定为“0.6BU/ml”。共识4FⅧ抑制物定量检测的参考范围为“0.6BU/ml”。推荐强度：强推荐，同意率：100.00%（16/16）。（三）检测限当样本的原倍管剩余FⅧ∶C75%时，通过计算可得其FⅧ抑制物滴度0.42BU/ml。尽管有学者

［

17］

通过实验得到“FⅧ抑制物滴度检测限为0.2BU/ml”的结论，但综合临床实际应用价值与国际血液学标准化委员会的相关指导文件

［

14］

，本共识建议在报告FⅧ抑制物定量检测结果时应将检测限定为“0.4BU/ml”（检测结果保留一位小数），即当样本的原倍管剩余FⅧ∶C75%时，其FⅧ抑制物滴度应报告为“0.4BU/ml”。若临床确有更高的需求，实验室需根据实际情况进行检测限的性能验证。共识5FⅧ抑制物定量检测的检测限为“0.4BU/ml”。推荐强度：推荐，同意率：81.25%（13/16）（四）检测灰区FⅧ抑制物定量检测（一期凝固法）结果2.0BU/ml为检测灰区，可采用回收试验进一步确认FⅧ抑制物是否存在；同时改用发色底物法（如条件允许）或重复一期凝固法进行FⅧ抑制物定量检测

［

4］

。六、FⅧ抑制物定量检测注意事项FⅧ抑制物定量检测需要注意以下事项：（一）中和性抑制物与非中和性抑制物使用Bethesda法或Nijmegen法可检测到的FⅧ抑制物是中和性抑制物，主要是免疫球蛋白G（immunoglobulin，IgG）（以IgG4亚类为主）

［

7，21］

。而非中和性抑制物的功能主要是加速FⅧ的清除，缩短FⅧ的半衰期

［

4，22,23］

，可以通过酶联免疫吸附法及免疫沉淀法等方法检测非中和性抑制物

［

6］

。（二）1型抑制物与2型抑制物HA患者的抗FⅧ同种抑制物多为1型抑制物，而AHA患者的抗FⅧ自身抑制物多为2型抑制物。1型抑制物的结合位点通常是FⅧ的A2或C2结构域，破坏了FⅧ与凝血因子Ⅸ复合物的形成。整个反应呈现1型反应动力学特征，抑制物可完全中和FⅧ。2型抑制物的结合位点通常是FⅧ的C2结构域，干扰了磷脂和血管性血友病因子的结合位点

［

6，24］

。整个反应呈现2型反应动力学特征，抑制物不可完全中和FⅧ。在FⅧ抑制物定量检测过程中，随着检测管稀释度的变化，1型抑制物的剩余FⅧ∶C结果与稀释度呈现线性-对数关系，而2型抑制物的剩余FⅧ∶C结果与稀释度无线性-对数关系

［

25］

，表现为多个稀释度检测管的剩余FⅧ∶C结果相近

［

7，18］

。因此在检测（疑似）AHA患者的样本或在发现上述现象时，应制备足够多的检测管进行检测

［

5，7］

，选择其中剩余FⅧ∶C最接近50%的检测管的结果进行最终的结果计算。共识6在（疑似）AHA患者的FⅧ抑制物定量检测或发现多个稀释度检测管的剩余FⅧ∶C结果相近时，应制备足够多的检测管进行检测。推荐强度：强推荐，同意率：100.00%（16/16）（三）样本保存本共识中提到的样本保存条件与时长是针对需同时检测凝血因子活性和凝血因子抑制物的样本而言。根据国外文献报道，仅需检测凝血因子抑制物时，可将样本置于-70℃冰箱保存15年

［

14］

。（四）Bethesda法与Nijmegen法相较于Bethesda法，Nijmegen法的改良主要是使用咪唑缓冲液调整NPP的pH及使用乏FⅧ血浆代替Bethesda法中的稀释液。这些改良可以减少37℃孵育时FⅧ的非特异性降解，进而提高FⅧ抑制物定量检测的特异性（即降低了假阳性）

［

7，13］

。国外多篇文献提出使用4%牛血清白蛋白溶液代替Nijmegen法中的乏FⅧ血浆并已证明此方法的可行性

［

7，14，18］

。而国内开展FⅧ抑制物定量检测的实验室多使用Bethesda法，一般使用仪器配套的因子稀释液代替咪唑缓冲液。结合多年临床实践经验，由此带来的差异尚可接受，但仍建议各实验室在开展FⅧ抑制物定量检测前进行相关的性能验证。（五）灭活与否及灭活时长之前的多个国内指南及专家共识均提出在未经过足够洗脱期（即48h）或FⅧ∶C5%时必须将样本进行灭活

［

1，3,4］

。考虑到部分实验室无法获取患者是否经过足够洗脱期的信息或未同步检测患者的FⅧ∶C，同时为推动FⅧ抑制物定量检测流程的标准化，本共识提出FⅧ抑制物定量检测时所有样本均需经过灭活。国内外有文献建议灭活条件为58℃孵育90min或58℃孵育30min等

［

1，18］

。而Boylan等

［

26］

提出58℃孵育30min可能导致IgG4降低，因此本共识结合国外相关文献

［

14］

及临床实践经验，推荐灭活条件为56℃孵育30min。（六）标准曲线制定本共识中提出的FⅧ抑制物定量检测的标准曲线的制定旨在推动FⅧ抑制物定量检测流程的标准化。需要注意的是，若通过该方法进行剩余FⅧ∶C检测，需间隔一定时间进行标准管的处理与检测管的稀释及处理。若同时处理，在使用标准管进行标准曲线制定时，检测管中的FⅧ与FⅧ抑制物会继续反应。尽管可以在制定标准曲线时，将待检的各稀释度检测管置于4℃冰箱，以降低FⅧ与FⅧ抑制物继续反应的程度，但两者间的反应并不可被完全终止。就制定标准曲线的必要性，考虑到实验室条件限制，对于尚无能力完成的实验室，可通过检测标准管和检测管的FⅧ∶C，进一步计算剩余FⅧ∶C的方式来进行FⅧ抑制物定量检测。（七）狼疮抗凝物质或其他凝血因子抑制物的干扰或艾美赛珠单抗的使用当样本中存在狼疮抗凝物质或其他凝血因子抑制物时，其FⅧ抑制物定量检测（一期凝固法）结果会存在假阳性的可能

［

6，27］

。在这些情况下，可使用发色底物法替代一期凝固法进行FⅧ抑制物定量检测。除此之外，当样本中存在狼疮抗凝物质时，还可以考虑使用含高浓度磷脂的APTT试剂的一期凝固法进行FⅧ抑制物定量检测

［

28］

。当HA患者使用艾美赛珠单抗时，使用一期凝固法无法真实地评估患者体内FⅧ抑制物滴度

［

14，29］

，应使用牛源性发色