DB11-T 1930-2021 放射工作人员健康检查染色体畸变和微核检测质量控制规范

CCSC60DB112021-12-28发布2022-04-0北京市市场监督管理局发布IDB11/T1930—2021 DB11/T1930—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由北京市卫生健康委员会提出。本文件由北京市卫生健康委员会归口。本文件由北京市卫生健康委员会组织实施。本文件起草单位：北京市疾病预防控制中心本文件主要起草人：李煜、罗环、梁婧、杨梦迪、王如刚、赵芳红、房云、蔡卫红、李隆飞、赵金萍、杨红艳、况海涛、于建平、高建华。DB11/T1930—20211放射工作人员健康检查染色体畸变和微核检测质量控制规范本文件规定了放射工作人员健康检査中，开展人外周血淋巴细胞染色体畸变检测和微核检测的基本要求、实验室及仪器设备要求以及检测的质量控制。本文件适用于放射工作人员健康检査中外周血淋巴细胞染色体畸变和微核检测的质量控制。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T28236染色体畸变估算生物剂量方法WS/T187淋巴细胞微核估算受照剂量方法GBZ98放射工作人员健康要求及监护规范GBZ112职业性放射性疾病诊断总则GBZ/T248放射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞染色体畸变检测与评价3术语和定义WS/T187界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1染色体畸变chromosomalaberration人员或细胞受到一定剂量电离辐射作用后，细胞中染色体发生的数量或结构上的改变。3.2微核细胞micronucleuscell胞质中含有微核的双核淋巴细胞。4基本要求4.1应建立实验室院感防控制度、医疗废弃物处理制度、手卫生制度等。4.2应每年参加职业健康检查质量控制机构组织开展的实验室间比对（包括复核独立完成，相关材料需归档保存。4.3技术人员要求4.3.1遗传实验室应有2名以上专业技术人员，专业技术人员应能及时准确完成检测工作。2DB11/T1930—20214.3.2技术人员知识技能要求4.3.2.1技术人员应了解、熟悉或掌握的理论知识包括但不限于以下内容：a)掌握实验室基本管理条例和生物安全知识；b)了解或熟悉相关法律、法规、国家及行业标准，包括《中华人民共和国职业病防治法》、《职业健康检查管理办法》、《中华人民共和国生物安全法》、GB/T28236、《职业射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞染色体畸变检测与评价》（GBZ/T248）、WS/T187c)熟悉电离辐射生物效应的基础知识、放射工作人员健康检查内容；掌握外周血淋巴细胞染色体畸变及微核检测的基本原理，明确其在辐射损伤评估中的作用；了解电离辐射诱发人淋巴细胞染色体畸变的剂量-效应曲线建立和用其估算生物剂量的方法。4.3.2.2技术人员应掌握的专业技能包括但不限于以下内容：a)样本接收、登记、保存程序；b)常用试剂的配制方法；c)生物安全柜、超净工作台、显微镜及摄像装置等仪器设备的正确使用与维护保养；配备全自动染色体扫描分析系统的实验室，应熟练掌握相关软件的使用；d)细胞培养方法；e)染色体和微核制片技术；f)染色体阅片应掌握性别识别、核型分析、染色体畸变和染色单体畸变的识别，使用规范符号记录染色体畸变类型；微核阅片应掌握识别双核淋巴细胞和微核；显微摄影技术；准确记录染色体畸变细胞及微核细胞坐标；g)准确完成报告和评价。4.3.3技术人员的培训与考核4.3.3.1检查机构需对接受培训人员进行理论知识及专业技能考核，染色体、微核制片合格率需达到80%以上，染色体畸变和微核识别准确率需达到90%以上，全部考核合格后方可上岗。4.3.3.2每年组织一次实验室内对相关技术能力的考核，进行能力确认。4.3.3.3技术人员至少每两年参加一次职业健康检查质量控制机构组织的实验室间比对。4.4仪器设备的管理4.4.1实验室主要仪器应建立档案，并有标准操作程序。4.4.2实验室主要仪器有使用及维护保养记录。4.4.3实验室仪器或设备按要求每年检定或校准，使其运行正常。4.5标本片、电子图片、原始记录、报告和档案的管理4.5.1有染色体和微核标本片、原始记录、报告和档案的存放地点，有专门的电子存储设备用于存储4.5.2标本片存放期限为2年，原始记录和报告存放期限为6年，图片等电子文件存放15年。4.5.3职业健康检查档案保存时间应当自放射工作人员最后一次职业健康检查结束之日起不少于15年。DB11/T1930—20215实验室及仪器设备要求5.1实验室5.1.1制片室面积宜大于20m2，应配备排风装置、水平离心机、负压移液装置或真空吸液泵、水浴锅等设备，宜选配细胞自动收获仪、自动制片机、自动染片机、自动接种仪等。5.1.2细胞培养间应配置生物安全柜或超净工作台、恒温培养箱、冰箱等。5.1.3显微阅片室应配置光学显微镜及摄像系统，宜选配全自动染色体扫描分析系统。5.2仪器设备及技术指标要求仪器设备及技术指标符合表1要求。表1仪器设备及技术指标要求////6染色体畸变检测质量控制6.1染色体畸变检测染色体畸变检测操作宜参照《放射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞染色体畸变检测与评价》（GBZ/T248）的规定。应采用培养开始加秋水仙素的方法。6.2样本的采集、运输和保存6.2.1血液采集应在所有放射性检查之前。3DB11/T1930—202146.2.2血液运输和保存的最佳温度为18℃~24℃。样本采集后应尽早接种，当日无法接种的样本保存时间不宜超过72h。6.2.3可接种到含植物凝集素培养基后于4℃~20℃保存。6.2.4每份样本应有唯一编号，编码规则由各实验室制定。6.3培养基的质量控制更换厂家或批次的培养基均应对至少两个血液样本进行比对实验，并有实验记录。6.4培养过程的质量控制血液标本应在37℃培养箱中培养48h～52h，培养箱内应放置温度计进行温度监测。中老年人血液样本宜接种多份平行样或适当延长培养时间。6.5染色体制片质量控制6.5.1合格中期细胞的选择染色体数目为46±1；染色体分散良好，长短粗细适中，背景干净，各条染色体可清楚辨认。见示例图1、图2和图3（1000×)。图1正常染色体图2双着丝粒体和无着丝粒断片图3着丝粒环和无着丝粒断片6.5.2出现以下情况的中期细胞不宜作计数分析：a)染色体数目少于45或多于47条；b)在同一细胞内染色体过于分散，不能在一个油镜视野内观察到；c)染色体形态过度细长或过度短粗；d)染色体呈扭曲状或紧缩成团；e)染色体分散不良，重叠太多；f)染色太深不能鉴别染色单体交叉重叠；g)同一条染色体的两条染色单体间距离过大。6.5.3染色体制片每样本能检出不少于200个合格中期分裂细胞。6.6阅片的质量控制6.6.1染色体畸变的表示符号应符合以下要求：a)畸变类型及表示符号应符合表2要求；DB11/T1930—2021b)若细胞中出现不同数目的双着丝粒体、着丝粒环、三着丝粒体以及无着丝粒体，表示符号应符合表3要求。表表2染色体畸变类型及表示符号rft表3表3细胞染色体畸变及表示方法6.6.2拍摄及原始记录应符合以下要求：畸变细胞坐和数目；胞变细胞标注阅片的数量应符合以下要求：c)在仪器使用记录上应记录每天阅片数量并签字。6.6.4如全自动染色体扫描分析系统拍摄到双着丝粒体或者着丝粒环等畸变，应该将此分裂相再次放到显微镜下并调整微调旋钮进行人工镜检，仔细辨认予以鉴定，并通过核型分析软件确认。如果使用双5DB11/T1930—20216着丝粒自动扫描分析系统识别双着丝粒体，仍需经人工分析判定，不应仅通过软件识别。6.6.5如果在分析100个中期分裂细胞中发现有双着丝粒体、着丝粒环、稳定性染色体畸变或3个及以上无着丝粒体，宜另外追加分析100个细胞，并计算此200个细胞的染色体畸变率进行结果评价，或通知受检者复查。6.6.6染色体畸变应由两名以上技术人员复核确认。6.6.7原始记录的格式宜参照《放射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞染色体畸变检测与评价》6.6.8对本年度拍摄的体检染色体图片抽检，识别准确率应达到90%以上。6.7报告的质量控制6.7.1报告的格式宜参照《放射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞染色体畸变检测与评价》（GBZ/T6.7.2检测结果异常者应附标注的畸变图像。6.7.3报告采取分析人、复核人双人签字。6.7.4应在体检结束之日起25个工作日内出具报告。7微核检测质量控制7.1微核检测应采用胞质分裂阻滞法（CB微核法）进行微核检测，操作规程宜参照WS/T187和附录A。7.2样本的采集、运输和保存、培养基的质量控制7.2.1样本的采集、运输和保存应符合6.2.1和6.2.2的要求。7.2.2培养基的质量控制应符合6.3的要求。7.3试剂松胞素-B的质量控制松胞素-B配制、保存和加入培养体系时均需避光。如更换试剂厂家应对至少两个血液样本进行比对实验，并有实验记录。7.4微核制片质量控制7.4.1双核淋巴细胞的判断应符合以下要求：a)双核淋巴细胞胞浆完整；b)胞浆和胞核能明确区分；c)一个双核淋巴细胞胞浆与邻近细胞的胞浆界限清楚；d)位于一个细胞质内、互相不连接的两个独立的核，如果有一个或多个核质桥连接，桥不宽于主核的1/4；e)两个核的大小接近，色度深浅相同；f)两个核不重叠，如果重叠必须能识别各自的边缘。7.4.2微核制片每样本能检出不少于1000个合格双核淋巴细胞。7.5阅片的质量控制DB11/T1930—202177.5.1微核的判断标准：见示例图4、图5和图6（400×)。a)微核直径为主核直径的1/16到1/3；b)微核呈圆形或椭圆形，结构与主核相同；c)微核与主核不连接，如有重叠或相切，必须能看到各自的边缘；d)微核染色与主核一致或略浅；e)微核不折光，与染料颗粒等人工产物相区别。图4正常双核淋巴细胞图51个细胞含1个微核图61个细胞含3个微核7.5.2拍摄及原始记录应符合以下要求：a)人工阅片的实验室需对微核细胞拍照，并在原始记录上记录显微镜编号、样本编号、微核细胞坐标；b)使用微核自动扫描分析系统的实验室需要在原始记录上记录显微镜编号、样本编号、微核细胞号，并需保存所有样本双核淋巴细胞图片。7.5.3阅片的数量应符合以下要求：a)对于人工阅片的实验室，每人每天分析不宜超过20个样本；b)具备微核自动扫描分析系统的实验室每天阅片数量不设限制；c)在仪器使用记录上应记录每天阅片数量并签字。7.5.4使用微核自动扫描分析系统的实验室需对双核淋巴细胞和微核图像人工分析判定，不应仅通过软件识别。7.5.5原始记录的格式宜参照附录B。7.5.6对本年度拍摄的体检微核细胞图片抽检，识别准确率应达到90%以上。7.6报告的质量控制7.6.1报告的格式宜参照附录C。7.6.2报告采取分析人、审核人双人签字。7.6.3应在体检结束之日起25个工作日内出具报告。DB11/T1930—20218（资料性）人外周血淋巴细胞微核检测规程A.1微核检测试剂准备A.1.1松胞素-B的配制A.1.1.1将5mg松胞素-B溶于2.5mL二甲基亚砜（DMSO）中，配成终浓度2g/L的储存液，-20℃避光冻存。A.1.1.2用时将储存液融化，吸取0.3mL，加入1.7mL生理盐水中，即为终浓度300mg/L的工作液。A.1.1.3配制过程需避光。A.1.2低渗液氯化钾（KCl）的配制称取氯化钾5.59g，加入去离子水使其充分溶解，定容到1000mL，配成0.075mol/L氯化钾溶液，常温保存备用。A.1.3固定液的配制取甲醇、冰乙酸，配成体积比3:1的固定液。固定液需在用前新鲜配制。A.2全血培养A.2.1外周静脉血采集体检时静脉血的采集应在所有放射性检查前进行。用肝素抗凝采血管采集受检者静脉血约2mL。A.2.2全血培养步骤A.2.2.1在培养瓶或离心管上编号并注明培养开始时间和日期。将采集的静脉血0.3mL～0.5mL加入到含5mLRPMI-1640培养液中，轻轻摇匀，37℃±0.5℃恒温培养箱内培养。A.2.2.2培养40h～44h后，加入松胞素-B至终浓度6mg/L，继续培养到66h～72h。A.3微核标本制备A.3.1低渗将培养后细胞于离心管以1000r/min～1500r/min(约200g～250g)离心8min～10min后，取出离心管，用吸管轻轻吸去上清液，每管加入8mL经37℃预温的0.075mol/LKCl，将细胞团块轻轻吹打混匀。A.3.2预固定DB11/T1930—20219低渗完毕，立即每管加入1mL新配制的固定液，用吸管吹打混匀，以1000r/min～1500r/min(约200g～250g)离心8min～10min。A.3.3第一次固定取出离心管，用吸管吸去上清液，每管中加入8mL固定液，用吸管快速吹打细胞团块并充分吹打混匀，常温下固定20min～30min，以1000r/min～1500r/min(约200～250g)离心8min～10min。A.3.4第二次固定取出离心管，重复第一次固定的操作。A.3.5制片取出离心管，吸去上清液，根据细胞团块的大小每离心管中留3滴～5滴固定液以调节细胞浓度，混匀。然后将细胞悬液滴到4℃冰箱预冷的洁净载玻片上，室温空气自然干燥。A.3.6编号对每一张微核标本片进行编号，并按照编号做好记录。A.3.7染色在pH6.8的磷酸缓冲