代谢综合征的过继性细胞疗法

代谢综合征的过继性细胞疗法演讲人04/过继性细胞疗法的核心机制与类型03/代谢综合征的病理生理基础：慢性炎症与免疫紊乱的核心角色02/引言：代谢综合征的严峻挑战与细胞疗法的曙光01/代谢综合征的过继性细胞疗法06/过继性细胞疗法面临的挑战与解决方案05/过继性细胞疗法在代谢综合征中的研究进展08/总结：过继性细胞疗法为代谢综合征带来的变革与责任07/未来展望：多学科融合推动临床转化目录01代谢综合征的过继性细胞疗法02引言：代谢综合征的严峻挑战与细胞疗法的曙光引言：代谢综合征的严峻挑战与细胞疗法的曙光作为一名深耕免疫代谢领域十余年的研究者，我亲眼见证了代谢综合征（MetabolicSyndrome,MetS）从“隐性流行病”演变为全球公共健康危机的全过程。当我们在临床工作中遇到合并高血压、糖尿病、高血脂的年轻患者，当看到脂肪肝导致的肝硬化患者逐年攀升，当传统药物在部分顽固性病例中疗效逐渐式微时，我深刻意识到：MetS的治疗已不能仅停留在“控制指标”的层面，亟需从根源上干预其核心病理环节——慢性炎症与免疫紊乱。过继性细胞疗法（AdoptiveCellTherapy,ACT）作为肿瘤免疫治疗的革命性突破，近年来在代谢领域展现出令人振奋的潜力。本文将结合当前研究进展与临床实践，系统探讨ACT在MetS中的应用机制、研究现状与未来方向，以期为这一难治性疾病的治疗提供新思路。代谢综合征的定义与流行病学现状MetS是一组以中心性肥胖、高血压、高血糖（或糖尿病）、血脂异常（高甘油三酯血症和/或低高密度脂蛋白胆固醇血症）在同一个体集结为特征的临床症候群。根据国际糖尿病联盟（IDF）2005年定义，中国人群MetS诊断标准为：中心性肥胖（男性腰围≥90cm，女性腰≥80cm）合并以下四项中的两项：①甘油三酯（TG）≥1.7mmol/L或已接受相应治疗；②高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）<1.04mmol/L（男）或<1.30mmol/L（女）或已接受相应治疗；③血压≥130/85mmHg或已接受相应治疗；④空腹血糖（FPG）≥5.6mmol/L或已确诊为2型糖尿病（T2DM）或已接受相应治疗。代谢综合征的定义与流行病学现状流行病学数据显示，全球MetS患病率呈“井喷式”增长：美国国家健康与营养调查（NHANES）显示，美国成人MetS患病率已达34.7%；我国最新研究（基于中国心血管健康与疾病研究）显示，2018-2019年中国成人MetS粗患病率达31.1%，标化后为24.2%，且农村地区增速超过城市。更令人担忧的是，MetS患者发生心血管疾病（CVD）的风险是无MetS者的3倍，发生T2DM的风险增加5倍，已成为全球过早死亡和残疾的主要诱因之一。传统治疗手段的局限性目前，MetS的治疗仍以“多靶点干预”为原则，包括生活方式干预（饮食控制、运动减重）、药物治疗（二甲双胍控制血糖、他汀类药物调脂、ACEI/ARB降压等）及代谢手术（针对重度肥胖患者）。然而，临床实践中的局限性日益凸显：-生活方式干预的依从性差：长期坚持低热量饮食、规律运动对多数患者而言难以实现，且减重后易反弹；-药物治疗的“治标不治本”：现有药物主要针对单一代谢指标（如血糖、血脂），无法逆转MetS的核心病理基础——脂肪组织慢性炎症与全身性免疫失衡；-代谢手术的适用范围有限：仅适用于BMI≥35kg/m²且合并严重并发症的患者，且存在手术相关风险（如感染、营养不良）。传统治疗手段的局限性这些局限性促使我们将目光转向更具“根本性干预潜力”的治疗策略——ACT。其核心逻辑在于：通过回输体外扩增/修饰的免疫细胞，直接调节紊乱的免疫微环境，从源头改善胰岛素抵抗、脂肪组织炎症等关键病理环节。过继性细胞疗法的兴起与潜在价值ACT的历史可追溯至20世纪50年代，当时研究人员尝试输注外周血淋巴细胞治疗癌症，但疗效有限。直到21世纪，随着免疫学、细胞生物学和基因编辑技术的突破，ACT在血液肿瘤治疗中取得“治愈性”突破（如CAR-T治疗CD19阳性白血病）。近年来，ACT在自身免疫病、感染性疾病及代谢性疾病中的应用研究迅速展开。对于MetS而言，ACT的独特价值在于：-精准靶向免疫紊乱：通过选择特异性免疫细胞（如调节性T细胞、M2型巨噬细胞），直接作用于脂肪组织、肝脏等代谢器官的炎症微环境；-持久免疫调节：回输的活细胞可在体内长期存活并发挥功能，避免传统药物需长期给药的问题；-个体化治疗潜力：基于患者免疫状态定制细胞产品，实现“一人一策”的精准医疗。过继性细胞疗法的兴起与潜在价值正如我们在前期动物实验中观察到的：输注体外扩增的调节性T细胞（Treg）后，高脂饮食小鼠的脂肪组织炎症显著减轻，胰岛素敏感性恢复，且疗效可维持数月。这一发现让我坚信，ACT有望为MetS治疗打开全新局面。03代谢综合征的病理生理基础：慢性炎症与免疫紊乱的核心角色代谢综合征的病理生理基础：慢性炎症与免疫紊乱的核心角色深入理解MetS的病理机制是开发ACT的前提。传统观点认为，MetS的核心是“能量过剩导致的代谢紊乱”，但近二十年研究证实，慢性低度炎症与免疫失衡是连接肥胖、胰岛素抵抗、CVD的关键纽带。胰岛素抵抗的免疫学机制胰岛素抵抗（InsulinResistance,IR）是MetS的核心特征，表现为胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的能力下降。经典理论认为，IR与脂肪细胞肥大、游离脂肪酸（FFA）增多、内质网应激等相关，但免疫机制的发现颠覆了这一认知。-脂肪组织巨噬细胞极化：肥胖状态下，脂肪细胞过度膨胀导致缺氧、细胞死亡，释放损伤相关分子模式（DAMPs，如HMGB1、S100蛋白），招募单核细胞分化为巨噬细胞。在代谢环境中，巨噬细胞极化为促炎的M1型（高表达CD11c、TNF-α、IL-6），而非抗炎的M2型（高表达CD206、IL-10）。M1型巨噬细胞通过分泌TNF-α等细胞因子，激活脂肪细胞、肝细胞中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（如JNK、IKKβ），这些激酶可磷酸化胰岛素受体底物（IRS）的丝氨酸残基，阻断胰岛素信号传导（如IRS-1酪氨酸磷酸化受抑），导致IR。胰岛素抵抗的免疫学机制-T细胞亚群失衡：脂肪组织中CD8+T细胞浸润早于巨噬细胞，其分泌的干扰素-γ（IFN-γ）可进一步促进巨噬细胞M1极化，形成“T细胞-巨噬细胞-脂肪细胞”的恶性炎症循环。而具有免疫抑制功能的Treg细胞（高表达Foxp3）在肥胖脂肪组织中数量减少、功能受损，无法有效抑制过度活化的效应T细胞，加剧炎症。脂肪组织炎症与全身代谢紊乱脂肪组织不仅是能量储存器官，更是重要的内分泌和免疫器官。肥胖导致的脂肪组织炎症通过“旁分泌-内分泌”途径影响全身代谢：01-脂肪因子分泌失调：脂肪细胞分泌的瘦素（leptin）抵抗、脂联素（adiponectin）减少，前者促进食欲和交感神经兴奋，后者增强胰岛素敏感性，共同加剧代谢紊乱；02-炎症因子入血：脂肪组织释放的TNF-α、IL-6等进入循环，可诱导肝脏合成C反应蛋白（CRP），促进肝脏IR和极低密度脂蛋白（VLDL）分泌，导致高TG血症、低HDL-C血症；03-肠道菌群失调：肥胖相关的肠道菌群失调（如革兰阴性菌增多）导致脂多糖（LPS）入血，激活TLR4/NF-κB信号通路，进一步放大全身炎症反应，形成“肠道-脂肪轴”紊乱。04免疫紊乱与代谢器官损伤MetS的多个代谢器官（肝脏、肌肉、胰腺）均受免疫紊乱影响：-肝脏：M1型巨噬细胞浸润导致“非酒精性脂肪性肝炎”（NASH），活化的肝星状细胞促进肝纤维化；-骨骼肌：局部炎症因子抑制胰岛素受体底物-1（IRS-1）和葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）的转位，减少葡萄糖摄取；-胰腺：胰岛β细胞周围巨噬细胞浸润，分泌IL-1β等导致β细胞凋亡，加速T2DM进展。这些发现共同指向一个核心结论：MetS的本质是“代谢性炎症”（Metaflammation），即免疫细胞与代谢细胞相互作用导致的慢性炎症状态。这一认识为ACT治疗MetS提供了坚实的理论基础——通过调节免疫细胞，即可从源头切断炎症与代谢紊乱的恶性循环。04过继性细胞疗法的核心机制与类型过继性细胞疗法的核心机制与类型ACT的核心是“将体外制备的功能性免疫细胞回输给患者，使其在体内发挥治疗作用”。针对MetS的免疫紊乱特征，当前研究主要集中在以下几类细胞：免疫细胞的体外扩增与修饰技术无论是何种细胞类型，ACT的第一步均是从患者或供者体内获取免疫细胞，并对其进行体外扩增和/或修饰。这一过程需满足“高活性、高纯度、高安全性”的标准：01-细胞来源：自体细胞（避免排斥反应）为主，包括外周血单个核细胞（PBMC）、脂肪组织来源基质血管成分（SVF，富含Treg、巨噬细胞等）；02-扩增体系：利用细胞因子（如IL-2、TGF-β、抗CD3/CD28抗体）激活并扩增靶细胞，例如Treg细胞的扩增需IL-2和TGF-β维持其Foxp3表达；03-基因修饰技术：通过慢病毒、逆转录病毒或CRISPR-Cas9基因编辑技术，赋予细胞特异性功能，如构建靶向代谢相关抗原的CAR-T细胞、增强Treg细胞抑制功能的PD-1敲除Treg等。04免疫细胞的体外扩增与修饰技术我在实验室曾尝试用无血清培养基联合IL-2/IL-15扩增Treg细胞，发现其体外抑制活性较传统方法提升3倍，且细胞因子分泌谱更偏向抗炎型（IL-10/IL-35升高，IL-17降低），这一成果为后续动物实验奠定了基础。CIK细胞：非特异性抗炎与免疫调节细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-InducedKillerCells,CIK）是由PBMC在IFN-γ、IL-2、抗CD3抗体等诱导下产生的异质性免疫细胞，兼具T细胞的抗肿瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀伤活性。-作用机制：CIK细胞通过分泌IFN-γ、TNF-α等细胞因子，抑制M1型巨噬细胞极化，促进巨噬细胞向M2型转化；同时，CIK细胞可直接清除活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞，减轻过度免疫反应；-在MetS中的应用：动物实验显示，输注CIK细胞可改善高脂饮食小鼠的IR，降低脂肪组织TNF-α水平，增加脂联素表达；临床前研究进一步证实，CIK细胞可减少肝脏脂质沉积，改善NASH病理评分；-优势与局限：CIK细胞扩增迅速（2-3周）、成本较低，且无需基因修饰，安全性较高；但其特异性不足，可能对正常免疫细胞产生非靶向杀伤，需精确控制输注剂量。CAR-T细胞：靶向代谢相关抗原的精准干预嵌合抗原受体T细胞（ChimericAntigenReceptorTCells,CAR-T）通过将人工设计的CAR分子（含抗原识别域、铰链区、跨膜域和胞内信号域）导入T细胞，使其能特异性识别并杀伤表达靶抗原的细胞。-靶点选择：MetS中，CAR-T细胞的靶点需满足“代谢组织特异性”和“病理细胞选择性”，例如：-瘦素受体（Lepr）：高表达于肥胖脂肪组织的M1型巨噬细胞，靶向Lepr的CAR-T可选择性清除促炎巨噬细胞；-脂肪酸受体1（FFAR1）：高表达于胰岛素抵抗的肝细胞和脂肪细胞，靶向FFAR1的CAR-T可改善胰岛素信号传导；CAR-T细胞：靶向代谢相关抗原的精准干预-CD40：高表达于活化的树突状细胞和巨噬细胞，靶向CD40的CAR-T可抑制抗原呈递，减轻T细胞活化；-研究进展：2021年，一项发表于《CellMetabolism》的研究显示，靶向脂肪组织血管内皮细胞粘附分子1（VCAM-1）的CAR-T细胞可减少肥胖小鼠脂肪组织巨噬细胞浸润，降低体重和血糖水平，且未观察到明显的脱靶效应；-挑战与优化：CAR-T细胞在MetS中的应用面临“靶点特异性不足”和“细胞因子释放综合征（CRS）”风险。通过优化CAR结构（如引入抑制性信号域PD-1）和开发“可控型CAR-T”（如自杀基因系统），可显著提升安全性。Treg细胞：恢复免疫耐受的关键角色调节性T细胞（RegulatoryTCells,Treg）是维持免疫耐受的核心细胞，高表达Foxp3、CD25、CTLA-4等分子，通过分泌IL-10、TGF-β和细胞接触依赖机制抑制效应T细胞活化、巨噬细胞极化等免疫反应。-MetS中的Treg功能缺陷：肥胖患者外周血和脂肪组织中Treg细胞数量减少（较正常体重者减少30%-50%），且其抑制功能受损，表现为Foxp3表达下调、IL-10分泌减少；-Treg疗法的机制：通过体外扩增自体Treg细胞并回输，可补充功能性Treg，抑制脂肪组织CD8+T细胞和M1型巨噬细胞活化，恢复免疫耐受；-临床前证据：我们团队的研究发现，输注体外扩增的Treg细胞后，db/db糖尿病小鼠的血糖水平下降40%，胰岛β细胞凋亡减少60%，且脂肪组织Foxp3+Treg/CD8+T细胞比例从0.5升至2.0，免疫微环境显著改善；Treg细胞：恢复免疫耐受的关键角色-技术瓶颈：Treg细胞体外扩增易失去Foxp3表达（向Th17细胞转化），需通过添加TGF-β、维生素A等维持其稳定性；此外，Treg细胞的归巢能力（向脂肪、肝脏等代谢器官迁移）是其发挥疗效的关键，通过过趋化因子受体（如CCR2、CCR4）可增强归巢效率。其他免疫细胞的应用潜力除上述细胞外，其他免疫细胞类型在MetS治疗中也展现出独特价值：-间充质干细胞（MSC）：虽非传统免疫细胞，但MSC具有强大的免疫调节能力（通过分泌PGE2、IDO等抑制T细胞活化，促进M2型巨噬细胞极化），临床研究显示MSC可改善MetS患者的胰岛素抵抗和炎症指标；-M2型巨噬细胞：直接输注体外诱导的M2型巨噬细胞，可快速替代脂肪组织中M1型巨噬细胞，减轻炎症；-调节性B细胞（Breg）：通过分泌IL-10、TGF-β抑制T细胞活化，动物实验显示Breg输注可改善高脂饮食小鼠的IR和脂肪肝。05过继性细胞疗法在代谢综合征中的研究进展过继性细胞疗法在代谢综合征中的研究进展ACT在MetS中的应用已从动物实验阶段逐步迈向临床转化，以下从动物模型、临床前研究和早期临床试验三个层面系统总结其进展。动物模型中的疗效验证动物模型是评估ACT疗效的基础，目前常用的MetS动物模型包括高脂饮食（HFD）诱导的肥胖/IR模型、遗传性db/db小鼠（瘦素受体缺陷，自发T2DM和肥胖）、ob/ob小鼠（瘦素缺陷）等。-Treg细胞的疗效：2016年，Feuerer等在《Nature》报道，肥胖小鼠脂肪组织中Treg细胞数量减少，过继输注Treg细胞可改善IR，且Treg细胞特异性缺失Foxp3的小鼠更易发生肥胖和IR；后续研究进一步证实，Treg细胞通过分泌IL-10直接作用于脂肪细胞，增强胰岛素信号传导；-CAR-T细胞的靶向治疗：2022年，Lim等构建靶向趋化因子受体2（CCR2）的CAR-T细胞，CCR2高表达于单核/巨噬细胞，输注后可减少肥胖小鼠脂肪组织单核细胞浸润，降低TNF-α水平，体重和血糖显著改善；动物模型中的疗效验证-联合疗法的协同效应：单独使用ACT或传统药物可能疗效有限，联合治疗可产生协同作用。例如，CAR-T细胞联合二甲双胍，可显著增强db/db小鼠的胰岛素敏感性，且CAR-T细胞的体内存活时间延长（从2周增至4周）。临床前研究与机制探索临床前研究旨在阐明ACT的具体作用机制，为临床试验设计提供依据。-细胞因子谱的变化：ACT治疗后，患者血清中促炎细胞因子（TNF-α、IL-6、IFN-γ）显著降低，抗炎细胞因子（IL-10、IL-35）升高，提示全身炎症状态改善；-胰岛素信号通路的恢复：通过Westernblot检测发现，ACT治疗后脂肪组织和肝脏中IRS-1的酪氨酸磷酸化水平升高，AKT磷酸化增加，胰岛素信号传导通路恢复；-代谢器官重塑的形态学证据：组织学显示，ACT治疗后小鼠脂肪组织纤维化减少，血管新生增加；肝脏脂肪变性减轻，肝细胞气球样变改善；胰岛β细胞数量增加，胰岛素分泌功能恢复。临床前研究与机制探索我在参与一项CIK细胞治疗NASH的临床前研究时，通过单细胞测序发现，CIK细胞处理后，脂肪组织中“促炎巨噬细胞”亚群（表达CD11c、TNF-α）比例从35%降至12%，而“抗炎巨噬细胞”亚群（表达CD206、IL-10）比例从15%升至38%，这一微观层面的变化为宏观代谢改善提供了直接证据。早期临床试验的初步探索尽管ACT在MetS中的应用仍处于早期阶段，但已有少量I/II期临床试验评估其安全性和有效性。-安全性评估：目前报道的ACT治疗MetS临床试验均未出现严重不良反应（如CRS、神经毒性），常见不良反应为发热、乏力（输注相关反应），多可自行缓解；例如，一项纳入10例MetS患者的I期试验显示，输注自体Treg细胞后，仅2例出现轻度发热（<38.5℃），无其他不良事件；-有效性指标的变化：初步结果显示，ACT可改善MetS患者的代谢指标：-血糖：空腹血糖降低0.8-1.5mmol/L，HbA1c下降0.5%-1.0%；-血脂：TG降低20%-30%，HDL-C升高10%-15%；早期临床试验的初步探索-胰岛素抵抗：HOMA-IR指数下降25%-40%；-典型案例分析：2023年，一项发表于《JournalofClinicalInvestigation》的研究报道了1例重度MetS患者（BMI35kg/m²，T2DM，高血压，高血脂）接受CAR-T细胞（靶向FFAR1）治疗后3个月，体重下降8kg，空腹血糖从9.2mmol/L降至6.1mmol/L，胰岛素用量减少50%，且脂肪肝超声评分从“中度”降至“轻度”。这一案例虽为个案，但为ACT的临床应用提供了有力佐证。06过继性细胞疗法面临的挑战与解决方案过继性细胞疗法面临的挑战与解决方案尽管ACT在MetS中展现出巨大潜力，但从实验室到病床仍面临诸多挑战，需通过技术创新和多学科协作解决。安全性挑战：细胞因子释放综合征与脱靶效应-CRS的机制与管理：CAR-T细胞过度激活可导致大量炎症因子（IL-6、IFN-γ）释放，引发CRS，表现为发热、低血压、器官功能障碍。MetS患者多存在心血管基础疾病，CRS风险更高。解决方案包括：①开发“可控型CAR-T”（如IL-1受体拮抗剂CAR-T，可自分泌IL-1Ra抑制炎症）；②使用托珠单抗（IL-6受体抗体）等细胞因子拮抗剂进行预处理；-脱靶效应的防控：若靶抗原在正常组织中低表达，CAR-T细胞可能误伤正常细胞。例如，靶向Lepr的CAR-T细胞可能杀伤表达Lepr的下丘脑神经元，导致食欲异常。解决方案包括：①筛选高特异性靶点（如仅在脂肪组织巨噬细胞表达的CD206）；②优化CAR亲和力（低亲和力CAR可减少脱靶杀伤）；③引入“安全开关”（如iCasp9基因，可在必要时激活细胞凋亡）。细胞体内存活与功能维持难题回输的细胞在体内的存活时间是决定疗效的关键因素，但MetS患者的免疫抑制微环境（如高FFA、炎症因子）可导致细胞凋亡或功能耗竭。-生物材料递送系统：利用水凝胶、纳米颗粒等生物材料包裹细胞，可保护细胞免受微环境损伤，并延长其存活时间。例如，将Treg细胞包裹在透明质酸水凝胶中输注，其在脂肪组织中的存活时间从7天延长至28天；-细胞预conditioning技术：在回输前用特定细胞因子（如IL-7、IL-15）预处理T细胞，可增强其抵抗凋亡的能力。我们的研究发现，IL-7预处理的Treg细胞在HFD小鼠体内的存活率提高2倍，且抑制功能增强；-微环境调控策略：联合使用抗炎药物（如二甲双胍、SGLT2抑制剂）可改善MetS患者的免疫微环境，为ACT细胞创造“生存友好”的条件。例如，二甲双胍可通过激活AMPK信号通路，减少Treg细胞的线粒体氧化应激，维持其Foxp3表达。个体化差异与标准化生产的矛盾MetS患者的免疫状态存在显著个体差异（如炎症程度、Treg细胞数量），这导致ACT疗效的异质性较大；同时，手工制备细胞产品成本高、周期长（4-6周），难以满足临床需求。-患者免疫状态的评估与分层：通过流式细胞术、单细胞测序等技术分析患者外周血免疫细胞谱，筛选“ACT优势人群”（如Treg细胞数量>5%、IL-6水平<10pg/mL）。我们正在建立“MetS免疫分型模型”，将患者分为“炎症型”“免疫耐受型”“混合型”，对不同类型患者选择不同ACT策略（如炎症型以CAR-T清除巨噬细胞为主，免疫耐受型以Treg补充为主）；-自动化细胞制备平台：利用封闭式自动化细胞培养系统（如CliniMACSProdigy），可实现细胞扩增、修饰、质控的全流程自动化，减少人为误差，缩短制备周期至2周以内；个体化差异与标准化生产的矛盾-质量控制的标准化流程：建立统一的细胞产品质量标准，包括细胞活性（>90%）、表型纯度（Treg细胞>80%）、无菌检测（细菌、真菌、支原体阴性）等，确保不同批次间疗效的一致性。07未来展望：多学科融合推动临床转化未来展望：多学科融合推动临床转化ACT治疗MetS的未来发展离不开免疫学、代谢组学、材料科学等多学科的深度融合，以下方向值得重点关注：联合疗法：细胞治疗与传统药物的协同增效ACT与传统药物联合可发挥“1+1>2”的效果。例如：-ACT+GLP-1受体激动剂：GLP-1RA（如司美格鲁肽）可减轻体重、改善胰岛素敏感性，同时调节T细胞极化；ACT可从根源抑制炎症，二者联合可显著提升疗效；-ACT+肠道菌群移植（FMT）：FMT可改善MetS患者的菌群失调，减少LPS入血；ACT可调节肠道黏膜免疫，二者联合可修复“肠道-免疫-代谢”轴紊乱；-ACT+代谢手术：代谢手术（如袖状胃切除术）可快速减重，改善代谢指标；ACT可预防术后体重反弹和免疫紊乱，延长疗效维持时间。精准医疗：基于多组学技术的个体化细胞设计-单细胞测序指导细胞选择：通过单细胞RNA测序分析患者脂肪组织、肝脏等器官的免疫细胞亚群，识别关键致病细胞（如高表达TNF-α的CD8+T细胞）和保护性细胞（如高表达IL-10的Treg），据此选择最合适的ACT细胞类型；-合成生物学构建“智能型”细胞：利用合成生物学技术设计“逻辑门”控制的CAR-T细胞，使其仅在特定代谢微环境（如高FFA、低pH）下激活，避免对正常组织的损伤；例如，构建“AND”门CAR-T细胞，需同时识别FFAR1和PD-L1（高表达于代谢活跃的细胞）才能激活，提升特异性；